Трансформированные клетки с различным метаститическим потенциалом; анализ дифференциально экспрессирующегося гена shMDG1

• Автор: Исаченко, Надежда Александровна
• Шифр специальности: 14.00.14
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 85 с. : 9 ил.

Оглавление

Основные обозначения и сокращения

Введение

Обзор литературы

Глава 1.

1. Основные свойства трансформированной клетки, обеспечивающие

процесс метастазирования

1.1. Потеря зависимости от ростовых факторов

1.2. Нечувствительность к ингибиторам роста

1.3. Уклонение от клеточной гибели

1.4. Способность к бесконечному делению

1.5. Способность к стимуляции ангиогенеза
2. Изменение клеточной адгезии - необходимое свойство
метастазирующей клетки
Глава 2.
3. Молекулярные шапероны в процессе канцерогенеза
3.1. Классификация шаперонов
3.2. Регуляция экспрессии шаперонов
3.2.1 Экспрессия шаперонов в опухолях
3.3. Роль шаперонов в индукции пролиферации и угнетении апоптоза
3.3.1. Шапероны плазматической мембраны
3.3.2. Шапероны цитозоля
3.3.3. Митохондриальные шапероны
3.3.4. Ядерные шапероны
3.3.5. Шапероны эндоплазматического ретикулума
3.4. Роль кошаперонов в определение специфичности и интеграции шаперонов Н8Р90 и ШР70
3.4.1. Молекулярные кошапероны класса Няр40 (МЭО!)
3.4.2. Открытие и исследования функций кошаперона ЕКф4/МЕ>01
Заключение

Материалы и методы
Список использованных растворов и сред
1. Эукариотические клеточные линии
2. Бактериальные штаммы и плазмидные векторы
3. Выделение нуклеиновых кислот
3.1. Выделение плазмидной ДНК
3.2. Выделение РНК из эукариотических клеток и тканей
3.3. Выделение ДНК из агарозных гелей
4. Электрофорез нуклеиновых кислот
4.1. Аналитический электрофорез ДНК в агарозных гелях
4.2. Электрофорез РНК в денатурирующих условиях
5. Блот - гибридизация РНК
5.1. Перенос РНК на нейлоновый фильтр Hybond N+
5.2. Получение зондов
5.3. Гибридизация
6. Молекулярное клонирование
6.1. Получение компетентных клеток E.coli
6.2. Трансформация
6.3. Обработка ДНК рестрицирующими эндонуклеазами
6.4. Реакция лигирования
6.5. Обратная транскрипция РНК
7. Полимеразная цепная реакция
8. Трансфекция
9. Получение лентивирусных стоков
10. Инфицирование клеток
11. Определение метастатической активности
11.1. Экспериментальная метастатическая активность (ЭМА)
11.2. Спонтанная метастатическая активность (СМА)
12. Трансфекция in vivo
13. Мечение лсктином
14. Проточная цитофлуориметрия

Результаты
1. Описание модельной системы
2. Анализ нуклеотидной последовательности одного из фрагментов кДНК, полученных из низкометастазируюшей клеточной линии НЕТ-SR методом дифференциального дисплея
3. Получение транслируемой области гена shMDGl
4. Изучение экспрессии гена shMDGl в клеточных линиях НЕТ-SR и HET-SR1
5. Получение клеточных культур НЕТ-SR и HET-SR1 с повышенной экспрессией гена shMDGl
6. Анализ пролиферативной активности клеточных линий НЕТ-SR, HET-SR1, HET-SR/shMDGl и HET-SRl/shMDG
7. Изучение влияния экзогенной экспрессии гена shMDGl на способность образования первичных опухолей и метастазов у экспериментальных животных
8. Изучение влияния инъекции ДНК гена shMDGl in vivo на способность опухоли метастазировать
З.Экспрессия поверхностных Р(1,6)-разветвлснных Asn-связанных олигосахаридов в изучаемых клеточных линиях
11. Сравнение уровня экспрессии мРНК человеческого аналога гена shMDGl (MDG1) в опухолевых и нормальных тканях
Обсуждение
Выводы
Список литературы

3.4.1. Молекулярные кошапсроны класса Нэр40 (ЕКсЦ4ЛУШС1).
Кошапероны, принадлежащие классу НБр40, активируют АТФазную активность Н8Р70 посредством высококонсервативного Едомена, содержащего 70 аминокислот [Викаи еч а!., 1998]. Кроме того, 1Ер40 определяют специфичность взаимодействия Н8Р70 с субстратом. В настоящее время множество представителей класса Нзр40 разделяют на три типа (табл. 2).
Классификация кошаперонов класса №р40 Таблица
Типы Доменная организация в
Hsp40 молекуле Hsp40
Представители/функции

J-домен G/F Zn2+
DnaJ - репликация бактериофага X Scjl - транслокация белков в ЭПР ERdj3/IIEI)J - транслокация белков в ЭПР

J-домен

ERtli4/MDC
Hdjl - укладка белков в цитоплазме
Hsjl
Hljl
hDj9

ERdjl/Mtjl
ERdj2/hScc63 - транслокация
белков в ЭПР
ERdjS
Jeml
Ауксилин - сборка клатриновых сетей
Р5811К-ингибитор PKR киназы Т-антиген — регуляция клеточного цикла, ДНК репликация, трансформация.
Змотмн - связывание ДНК
Csp - экзоцитоз
TID56 - опухолевый супрессор
MIDA1 - регуляция роста клеток
эритролейкемии крыс
Mdj2p - импорт белков в
митохондрию
Примечания: показаны Д-домен, район богатый глицином и фенилаланином (СІу/РІїе), и район богатый цистеином (Суя). Резидентные белки эндоплазматического ретикулума отмечены красным цветом.
К I типу относится канонический бактериальный Опа], который содержит три домена, характерных для Нзр40, - Кдомен, домен, богатый глицином и фенилаланином