Разработка ПЦР-тест-систем для видовой идентификации и количественной оценки мясного сырья в составе мелкоизмельченных полуфабрикатов и готовых мясных продуктов

• Автор: Комарова, Ирина Николаевна
• Шифр специальности: 16.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 182 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Основные положения об идентификации и фальсификации пищевого сырья и
готовой продукции
1.2 Виды фальсификаций мясного сырья, полуфабрикатов и готовых мясных
изделий
1.3 Органолептические и морфологические показатели видовой принадлежности
мяса и мясных продуктов
1.4 Физико-химические показатели видовой принадлежности мяса и мясных
продуктов
1.5 Инструментальные методы идентификации и выявления фальсификаций
видового состава мясного сырья и готовых мясных продуктов
1.6 Сущность полимеразной цепной реакции (ПЦР)
1.7 Применение метода ПЦР для видовой идентификации мясного сырья и
продуктов животного происхождения
1.8 Количественная оценка содержания компонентов животного происхождения
в составе мясного сырья, полуфабрикатов и готовых мясных изделий с использованием метода ПЦР
1.9 Заключение
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Материалы и методы
2.1.1 Объекты исследования
2.1.2 Методы выделения ДНК из проб исследуемого материала
2.1.3 Метод полимеразной цепной реакции (амплификация ДНК)
2.1.4 Метод электрофоретического анализа продуктов ПЦР
2.1.5 Учет и интерпретация результатов ПЦР
2.1.6 Конструирование и калибровка внутренних стандартов для конкурентной ПЦР
2.1.7 Метод кольцепреципитации в капиллярах
2.1.8 Метод иммунодиффузии с бумажными дисками
2.2. Результаты исследований
2.2.1 Разработка и испытание однолокусных и мультилокусной ПЦР-тест-систем для видовой идентификации тканей крупного рогатого скота, свиней и кур в составе мясного сырья и готовых мясных продуктов
2.2.1.1 Подбор ДНК-мишени, конструирование видоспецифичных праймеров и выбор метода экстракции ДНК
2.2.1.2 Оптимизация процесса амплификации в однолокусных и мультилокусной ПЦР
2.2.1.3 Изучение специфичности и чувствительности однолокусных и мультилокусной ПЦР
2.2.1.4 Конструирование контролей работы однолокусных и мультилокусной ПЦР-тест-систем
2.2.2 Разработка методики конкурентной ПЦР для количественной оценки содержания компонентов животного происхождения в составе мясного сырья, полуфабрикатов и готовых мясных изделий
2.2.2.1 Конструирование внутренних стандартов для постановки конкурентной ПЦР
2.2.2.2 Калибровка внутренних стандартов и определение точек эквивалентности для количественного определения ДНК крупного рогатого скота, свиней и кур методом конкурентной ПЦР
2.2.3 Изучение влияния технологической обработки мясного сырья на эффективность различных методов видовой идентификации
2.2.3.1 Влияние условий хранения мясного сырья на эффективность иммунологических и ПЦР методов видовой идентификации
2.2.3.2 Влияние термической обработки мясного сырья на эффективность иммунологических и ПЦР методов видовой идентификации
2.2.4 Обсуждение результатов исследования
3. Выводы
4. Практические предложения
5. Список литературы
6. Приложение (акт)
Актуальность темы диссертации. Формирование в России рыночных условий развития общества, резкое увеличение объема частного производства и свободной торговли продовольственными товарами, в том числе мясным сырьем, полуфабрикатами и готовыми мясными продуктами, предопределяют возможность различной их фальсификации но структуре и видовой принадлежности сырьевых составляющих. По экономическим соображениям чаще всего фальсифицируют малоценное мясное сырье, продукцию второго и третьего сортов, реализуя их как продукцию высокого качества.
В последние годы на рынках и торговых предприятиях нашей страны заметно увеличился сбыт фальсифицированных продовольственных, в том числе мясных товаров как отечественного, так и импортного производства. Принятые в России законы «О ветеринарии» (14.05.93), «О защите прав потребителя»
(05.12.95), «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» (30.03.99), «О качестве и безопасности пищевых продуктов» (02.01.02), направленные на строгое соблюдение определенных требований к сырью и продукции, еще не обеспечивают полного исключения фальсификации различных продуктов.
Показатели качества и безопасности сырья и продуктов животного происхождения, определяемые в Системе обязательной сертификации ГОСТ Р, представлены в Санитарных правилах и нормах (СанПиН 2.3.2. 1078-01). По данным ряда исследований, мясные продукты, не отвечающие требованиям Правил ветсанэкспертизы, ГОСТ и других нормативных документов, составляют в отдельных торговых предприятиях и на рынках до 12-35% от числа всех проверенных партий. Имеются случаи реализации фальсифицированных продуктов, сопровождавшихся ветеринарными документами и сертификатами соответствия, указывающими на их подлинное происхождение и проведенный лабораторный контроль качества.
В настоящее время особенно остро стоит вопрос о необходимости более достоверного определения, как видовой принадлежности блочного мясного сырья, так и состава мясных мелкоизмельченных продуктов. Это обусловлено тем, что из-за фальсификации мясного сырья по видовому составу не только
- Сорбент.
Протокол экстракции с использованием набора реагентов “Silica М”:
1. Согласно Методическим указаниям к набору реагентов “Silica М”, осуществляли приготовление рабочих буферных растворов ОБ: к содержимому флакона с концентратами буферов ОБ 1 и ОБ 2 добавляли по 40 мл 96%-ного этилового спирта и перемешивали содержимое путем переворачивания плотно закрытого флакона 5-6 раз.
2. В пробирку с исследуемым образцом вносили 600 мкл буфера ЛБ. Перемешивали содержимое при помощи гомогенизатора Поттера до полного смачивания пробы.
3. Инкубировали пробирку с пробой в твердотельном термостате 40 мин при 65°С.
4. Содержимое пробирки встряхивали на вортексе «ТЭТА 2» («Биоком»), а затем центрифугировали 10 мин при 10 тыс. об./мин.
5. Надосадочную жидкость, не задевая осадка, полностью отбирали с помощью автоматической пипетки («Колор») и переносили в чистую пробирку, меняя наконечники при переходе от пробы к пробе.
6. Добавляли в пробирку с надосадочной жидкостью 40 мкл суспензии сорбента (перед использованием сорбент суспендировали на вортексе до исчезновения осадка).
7. Содержимое пробирки с пробой встряхивали на вортексе до полной гомогенизации и оставляли в штативе на 7-10 мин для связывания ДНК с сорбентом.
8. Центрифугировали пробирку 10 сек при 10 тыс. об./мин., надосадочную жидкость удаляли автоматической пипеткой, не задевая при этом осадка.
9. К осадку прибавляли 500 мкл буфера ОБ 1, содержимое пробирки встряхивали на вортексе до полного суспендирования осадка.
10. Центрифугировали пробирку 10 сек при 2 тыс. об./мин., надосадочную жидкость удаляли при помощи автоматической пипетки, не задевая при этом осадка.
11. К осадку добавляли 500 мкл буфера ОБ 2, содержимое пробирки встряхивали на вортексе до полного суспендирования осадка.