Создание гипериммунного протективного антигена Bacillus anthracis для иммунопрофилактики сибирской язвы

• Автор: Щербинин, Дмитрий Николаевич
• Шифр специальности: 14.03.09
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 99 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА Е ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Факторы вирулентности Bacillus anthracis

1.2 Особенности иммунного ответа к Bacillus anthracis

1.3 Клеточный иммунный ответ к сибиреязвенным бациллам

1.4 Подходы к созданию вакцин от сибирской язвы

1.5 Используемые в настоящее время противосибиреязвенные вакцины

1.6 Рекомбинантный аденовирус человека пятого серотипа и его применение для генетической иммунизации

ГЛАВА 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы
2.1.1 Вирусы и бактериальные штаммы
2.1.2 Клеточные линии
2.1.3 Плазмидные векторы
2.1.4 Ферменты и другие реактивы
2.1.5 Лабораторные животные
2.1.6 Лабораторное оборудование
2.2 Методы исследования
2.2.1 Бактериологические методы
2.2.2 Генно-инженерные методы
2.2.3 Вирусологические методы
2.2.4 Молекулярно-биологические методы
2.2.5 Серологические методы
2.2.6 Методы работы с животными
2.2.7 Статистическая обработка результатов исследований
2.2.8 Биоинформатические методы
2.3 Результаты исследований
2.3.1 Дизайн генетических конструкций сРА, зРА, РА-Бс
2.3.2 Получение челночных плазмид рБЬ-сРА, рБЬ -эРА, рБй -РА-Бс..
2.3.3 Получение рекомбинантных аденовирусов Ай-сРА, Ай-эРА, Ай-РА-Бс
2.3.4 Изучение экспрессии генов сРА, зРА, РА-Бс из состава рекомбинантных аденовирусов методом вестерн-блотта
2.3.5 Определение антиген-специфического лимфопролиферативного ответа к протективному антигену у мышей, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами Ай-РА-Бс, Ай-зРА и Ай-сРА
2.3.6 Оценка индукции антител класса к РА в сыворотках крови мышей, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами, методом ИФА
2.3.7 Оценка методом ИФА подклассов антител 1§в специфических к РА в сыворотках крови мышей
2.3.8 Изучение протективных свойств рекомбинантных аденовирусов Ай-сРА, Ай-зРА, Ай-РА-Рс против В. аткгааз методом контрольного заражения лабораторных животных
2.3.9 Изучение длительности защитных свойств у лабораторных животных, интраназально иммунизированных рекомбинантными аденовирусами Ай-сРА, Ай-зРА, Ай-РА-Бс

2.3.10 Оценка методом ИФА индукции антител класса 1§в к РА в сыворотках крови морских свинок, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами
2.3.11 Оценка защитных свойств гипериммунного протективного антигена на модели летальной сибиреязвенной инфекции на морских свинках
2.3.12 Оценка напряженности иммунного ответа при иммунизации гипериммунным протективным антигеном
ГЛАВА 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

pBluescript II SK (+) (концентрация 1 мкг/мкл), в разведении 10'6-10'8. Трансформированные клетки высеивали на питательную среду LB с антибиотиком ампициллином, ген устойчивости к которому несет плазмида. В работе использовали компетентные клетки E. coli DH5a с эффективностью, обеспечивающей трансформацию плазмидной ДНК в количестве 10‘8 мкг.
Приготовление компетентных клеток E. coli штамма BJ5
Для подготовки электрокомпетентных клеток свежевыращенную культуру E. coli высевали в 500 мл LB-бульона и выращивали при постоянном перемешивании (300 об/мин) при 37°С до OD60o= 0,5 - 0,7. Затем суспензию клеток помещали в охлажденную центрифужную пробирку. Центрифугировали при 4000 об/мин в течение 15 минут при 4°С. Тщательно сливали супернатант и аккуратно ресуспендировали осадок в 500 мл ледяного 10% глицерола. Центрифугировали полученную суспензию при 4000 об/мин в течение 15 минут при 4°С. Тщательно сливали надосадочную жидкость, ресуспендировали осадок в 250 мл ледяного 10% глицерола и снова центрифугировали при тех же условиях. Тщательно сливали супернатант, ресуспендировали осадок в 20 мл ледяного 10% глицерола и переносили суспензию клеток в стерильные 15-мл центрифужные пробирки и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 15 минут при 4°С. Удаляли супернатант и ресуспендировали осадок клеток в конечном объеме 1-2 мл ледяного 10% глицерола (концентрация клеток была приблизительно 1-ЗхЮ10 клеток/мл). Эту суспензию разливали по аликвотам.
Для проверки эффективности полученных электрокомпетентных клеток E.coli проводили трансформацию нескольких аликвот клеток плазмидой pBluescript II SK (+) (концентрация 1 мкг/мкл), в разведении 10'6 -10‘8 методом электропорации. Трансформированные клетки высеивали на питательную среду LB с антибиотиком ампициллином, ген устойчивости к которому несет плазмида. В работе использовали компетентные клетки Е. coli штамма BJ5183 с эффективностью, обеспечивающей трансформацию