Внутриклеточное содержание белков теплового шока 70 КДА и его взаимосвязь с продукцией активных форм кислорода в нейтрофилах человека при старении

• Автор: Бойко, Анна Александровна
• Шифр специальности: 14.03.09
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 136 с. : ил.

Список сокращений
I. Обзор литературы
1.1. Нейтрофилы, их характеристика
1.1.1. Нейтрофильные гранулы
1.1.2. Поверхностные маркеры нейтрофилов
1.2. Функции нейтрофилов и их роль в системе иммунитета
1.2.1. Фагоцитоз
1.2.2. Дегрануляция
1.2.3. Нейтрофильные внеклеточные ловушки
1.2.4. Активные формы кислорода в нейтрофилах
1.2.4.1. Пути образования и метаболиты АФК в нейтрофилах
1.2.5. Роль нейтрофилов в патологических процессах
1.3. Регуляция активности нейтрофилов
1.4. Белки теплового шока
1.4.1. Семейство белков теплового шока 70 кДа
1.4.2. Внутриклеточные функции НБР70
1.4.3. Внеклеточные функции Н8Р70
1.4.4. НБР70 в нейтрофилах
1.5. ШР70 и окислительный стресс
1.6. Механизмы секреции Н8Р70
1.7. Причины и иммунологические аспекты процесса старения
1.7.1. Основные теории развития старения
1.7.2. Ассоциированные с возрастом изменения в нейтрофилах
1.7.3. Н8Р70 при старении
И. Материалы и методы
2.1. Реагенты

2.2. Выделение нейтрофилов из периферической крови и подготовка образцов
2.3. Проточная цитофлуориметрия
2.3.1. Оценка жизнеспособности нейтрофилов
2.3.2. Цитометрический анализ внутриклеточного уровня Н8Р70
2.3.3. Цитометрический анализ поверхностной экспрессии Н8Р70 и маркеров дегрануляции
2.3.4. Цитометрическое измерение внутриклеточной
продукции АФК
2.4. Анализ внутриклеточного содержания Н8Р70 методом Вестерн-блоттинга
2.5. Измерение продукции АФК с помощью люминол-зависимой хемилюминесценции
2.6. Статистический анализ данных
2.7. Измерение транскрипционной активности генов Н8Р70 с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (цИТ-РСЯ)
2.7.1. Проведение цКТ-РСЯ
2.7.2. Статистическая обработка данных цКТ-РСЯ
2.8. Оценка внеклеточного уровня Н8Р70 с помощью ИФА
III. Результаты
3.1. Внутриклеточное содержание Н8Р70 в интактных нейтрофилах в разных возрастных группах
3.2. Динамика изменения уровня Н8Р70 в нейтрофилах под действием теплового шока
3.2.1. Транскрипционная активность генов белков Н8Р70 в нейтрофилах под действием теплового шока
3.2.2. Анализ динамики внутриклеточного уровня Н8Р70 в нейтрофилах под действием теплового шока
3.3. Анализ экспрессии Н8Р70 в мононуклеарных клетках человека

3.4. Анализ двухфазной динамики внутриклеточного уровня Н8Р70 в нейтрофилах под действием теплового шока
3.5. Воздействие гипертермии на уровень ЩР70 в нейтрофилах в разных возрастных группах
3.6. Высвобождение Н8Р70 из нейтрофилов во внеклеточное пространство
3.7. Анализ механизмов, регулирующих высвобождение Н8Р70 во внеклеточное пространство из нейтрофилов
3.8. Спонтанная и индуцированная продукция АФК в разных возрастных группах
3.9. Анализ взаимосвязи между продукцией АФК и содержанием Н8Р70 в
нейтрофилах в разных возрастных группах
IV. Обсуждение
Выводы
Список литературы

результате инвагинации эндосомной мембраны. Эти тельца могут сливаться с клеточной поверхностью и экзосомы высвобождаются наружу. Этот механизм отличается от механизма образования микрочастиц и эктосом непосредственно из плазматической мембраны в результате ее выпячивания.
Высвобождение Hsp70 в составе экзосом наблюдали в макрофагах [Bhatnagar et al., 2007], в В-клетках, подвергнутых ТШ, и в мононуклеарных клетках, нативных и стрессированных нагреванием [Clayton et al., 2005; Hunter-Lavin et al., 2004; Lancaster and Febbraio, 2005]. Экзосомный механизм высвобождения Hsp70 описан при стимуляции опухолевых клеток провоспалительными цитокинами IFNy и IL-10 [Bausero et al., 2005]. Следует уточнить, что при такой стимуляции высвобождение в экзосомах было частичным, так как Hsp70 высвобождался во внеклеточное пространство и в свободной форме. Одним из факторов, способствующих высвобождению Hsp70 в составе экзосом, может являться активация симпатической нервной системы. Высвобождение норадреналина и последующая активация al-адренорецепторов увеличивает запас внутриклеточного Са++, что, как считают авторы, может стимулировать секрецию экзосом с содержащимся в них FIsp70 [Johnson and Fleshner, 2006]. Более того, по всей видимости, существует два пути высвобождения Hsp70 в составе экзосом. В ответ на ТШ на В-лимфоцитах увеличивается количество высвобождаемых экзосом, содержащих внутри FIsp70 [Clayton et al., 2005], в то время как в моноцитах человека в ответ на стресс увеличивается концентрация Hsp70 внутри и на поверхности экзосом без увеличения их количества [Lancaster and Febbraio, 2005].
Также было показано, что после стресса Hsp70 интегрируется в липидный бислой мембраны и высвобождается во внеклеточное пространство в мембрано-ассоциированном состоянии в виде везикул. Внеклеточные мембраны, заключающие в себе Hsp70, многократно эффективнее, чем очищенный рекомбинантный белок, индуцировали