Разработка экспресс-тестов для оценки ранних реакций клеточного иммунитета

• Автор: Кожушный, Андрей Петрович
• Шифр специальности: 14.03.09
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 198 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 Клеточный иммунитет: виды и значение при вирусных

инфекциях

1.1 Врожденный и адаптивный клеточный иммунитет

1.2 Общая характеристика иммунных ответов на антигены ВГВ

1.3 Роль активации клеток и нарушения баланса цитокинов в патогенезе ВИЧ-

инфекции

2 Клеточный иммунитет: методы исследования

2.1 Общая характеристика методов исследования клеточного иммунитета
2.2 Автоматизация методов ПММ/РТМЛ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3 Материалы
3.1 Контингент обследуемых лиц
3.2 Антигены
3.3 Используемые тест-системы
3.4 Дополнительные реагенты
4 Методы исследования
4.1 Функциональные клеточные тесты для определения продукции цитокинов
и экспрессии маркеров активации клеток in vitro
4.2 База данных и статистические методы
РЕЗУЛЬТАТЫ
5 Разработка экспресс-тестов in vitro для выявления ранних
реакций клеточного иммунитета
5.1 Алгоритм и методика тестирования реакций в уплотненных
микрокультурах (УМК) и разреженных микрокультурах (РМК) лейкоцитов периферической крови человека (ЛГЖЧ)
5.2 Кинетика развития антиген/митоген-сттимулированной и спонтанной продукции цитокинов в уплотненных и разреженных микрокультурах клеток65
5.3 Антиген-/митоген-стимулированная продукция цитокинов на разные виды
антигенов после 18 часовой инкубации (в контрольной группе)
6 Исследование клеточной миграции в уплотненных
микрокультурах клеток (УМК) в разных группах

6.1 Подбор концентраций и кинетика развития реакции клеточной миграции
на разные антигены
6.2 Оценка специфического клеточного иммунитета при вакцинации против гепатита В
6.3 Ранние реакции клеточного иммунитета у носителей HBsAg
6.4 Параметры клеточной .миграции в группах риска и у больных вирусными инфекциями (ВГВ и ВИЧ)
7 Мониторинг параметров клеточного иммунитета у лиц,
вакцинированных против гепатита В и при вирусных патологиях (ВГВ и ВИЧ)
7.1 Мониторинг ранней HBsAg-стимулированной продукции цитокинов при вакцинации против гепатита В
7.2 Мониторинг параметров клеточного иммунитета у лиц с патологиями
печени и ВИЧ-инфицированных лиц
7.3 Результаты исследований клеточного иммунитета в группах риска и у
больных вирусными инфекциями (ВГВ и ВИЧ)
ОБСУЖДЕНИЕ
8 Методология уплотненных и разреженных микрокультур
клеток (УМК и РМК)
9 Параметры врожденного иммунитета при ВГВ
инфицировании определяемые в УМК и РМК
10 Исследование реакций клеточного иммунитета при
вакцинации против ВГВ
11 Исследование реакций клеточного иммунитета при
вирусных гепатитах и ВИЧ-инфекции
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ:
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
12 Приложение
13 Приложение
14 Приложение
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
HBsAg поверхностный антиген ВГВ
LIF фактор подавления миграции лейкоцитов
MIF фактор подавления миграции макрофагов
MSF фактор стимуляции миграции
NK натуральные киллеры
PMA форбол-миристат ацетат
PWM митоген лаконоса
AT антиген
АПК автоматизированный программный комплекс
ВГВ вирус гепатита В
ВГС вирус гепатита С
ВИЧ вирус иммунодефицита человека
гзт гиперчувствительность замедленного типа
им индекс миграции
ис индекс стимуляции
исг интерферон-стимулированные гены
ИФА иммуноферментный анализ
КИА коэффициент индуцированной активности
кк купферовские клетки
кос коэффициент относительной стимуляции
КСА коэффициент спонтанной активности
лпкч лейкоциты периферической крови человека
мг митоген
мкпк мононуклеарные клетки периферической крови
мел манноз-связывающие лектины
оп оптическая плотность
пмм подавление миграции макрофагов
ПРР паттерн распознающие рецепторы
ПЦР полимеразная цепная реакция
рВГВ рекомбинантная вакцина против ВГВ
РМК разреженные микрокультуры клеток
РТМЛ реакция торможения миграции лейкоцитов
сткм скрининговый тест клеточной миграции
ТЛР «толл-лайк (toll-like)» рецепторы
ТМБ тетраметилбензидин
товц тест для определения внутриклеточных цитокинов
тим тест подавления миграции
УМК ' уплотненные микрокультуры клеток
ФГА фитогемагглютинин
ФСБ фосфатно-солевой буфер
ФСБ-Т фосфатно-солевой буфер с твином
хзп хроническое заболевание печени

альвеолярными макрофагами и вызывает пролиферацию легочных СБ8+ Т-клеток (111).
1.3.2 Перестройка цитокиновых профилей при ВИЧ-инфекции
Последние исследования показывают, что патогенез ВИЧ является, скорее всего, результатом нарушения баланса между вирусом и иммунной системой. Он определяется, прежде всего изменением механизмов, ответственных за гомеостаз и размножение Т-лимфоцитов. Этот патогенез проявляется в нарушении нормального межклеточного взаимодействия, в том числе, в изменении цитокиновых спектров, в смене нормального распределения («пейзажа») клеточных рецепторов и маркеров, включая маркеры клеточной активации, на патологический деструктивный статус (134).
Цитокины играют важную роль в контроле гомеостаза 'иммунной системы. Они являются важнейшим средством межклеточной коммуникации в иммунной системе, прежде всего, в ходе развития иммунного ответа против антигенов и инфекционных агентов. Многочисленные исследования позволили утвердить концепцию того, что различные активности разных типов Т-хелперных клеток - ТЫ и Т1т2 - определяются их разными цитокиновыми профилями. Благодаря разным наборам цитокинам развивается иммунный ответ ТЫ-типа и ТЬ2-типа. Ответ ТЫ-типа ассоциирован с продукцией иммуноглобулинов класса 1ц02а и развитием клеточного иммунитета, тогда как ответ ТЫ-типа с синтезом иммуноглобулинов класса ТцЕ, продукцией эозинофилов и тучных клеток (19).
Макрофагами и Т-лимфоцитами продуцируются разные цитокины. Спектр цитокинов, секретируемых макрофагами характеризуется присутствием ГБЫ-а/р, ТПБ-а, 1Т-10 и 1Т-12, тогда как цитокиновый спектр Т-клеток - присутствием 1ББ1-у, ГЬ-2, ГЬ-4, 1Ь-10, 1Ь-13 и ТОБ-р. Эти цитокины определяют взаимодействие Т-клеток и макрофагов, дифференцировку в ходе иммунного ответа клеток ТЬ в клетки типа ТЫ или