Молекулярные механизмы цитостатического и химиосенсибилизирующего действия гестагенов на опухолевые клетки

• Автор: Федотчева, Татьяна Александровна
• Шифр специальности: 14.03.06
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 199 с. : 45 ил.

Оглавление
1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Цитотстатическое действие гестагенов

2.1.1. Рецепторы прогестерона и эстрадиола.

2,1.2, Роль определения подтипов рецепторов прогестерона и

эстрадиола в лечении гормонозависимых опухолей

2.1.3.Функциональная активность эстрогеновых рецепторов

2.1.4. Функциональная активность прогестероновых рецепторов

2.1.5. Прогностическое значение подтипов рецепторов эстрадиола в

лечении гормонозависимых опухолей

2.1.6. Прогностическое значение подтипов рецепторов прогестерона в
лечении гормонозависимых опухолей
2.1.7. Механизмы цитостатической активности гестагенов
2.2. Химиосенсибилизирующее действие гестагенов
2.2.1. Факторы мультилекарственной резистентности
2.2.2. Фармакологическая регуляция МЛР
2.2.3. Гестагены как химиосенсибилизаторы
2.3. Гестагены и митохондрии
2.4. Общие механизмы взаиморегуляции МТП и МЛР гестагенами
3. Материалы и методы исследования
3.1. Химическая структура изучаемых гестагенов
3.2. Используемые реактивы
3.3. Объекты исследования
3.4. Метод культивирования клеток
3.5. Определение активности митохондриальной поры (МТП)
3.6. Методы оценки противоопухолевой активности изучаемых
соединений
3.6.1. Интегральный МТТ-тест оценки жизнеспособности и
метаболической активности опухолевых клеток
3.6.2. Оценка влияния соединений на пролиферативную активность
опухолевых клеток по включению 3Н-тимидина в ДНК
3.6.3. Оценка противоопухолевой активности соединений на мышах
3.6.3.1. Оценка противоопухолевой активности мецигестона и бутерола на перевиваемом мышам раке шейки матки РШМ-
3.6.3.2. Оценка химиосенсибилизирующей активности бутерола на перевиваемом остром лейкозе мыши Р388, резистентном к винкристину
3.7. Анализ специфических участков связывания 3Н-прогестерона (3Н-Р4) и относительной связывающей способности (ДВА) исследуемых гестагенов со специфическими участками связывания прогестерона в культурах клеток
3.8. Оценка параметров резистентности опухолевых клеток к доксорубицину и влияния на них исследуемых соединений
3.8.1. Метод определения МЛР опухолевых клеток по кинетике выхода родамина
3.8.2. Метод определения активности глутатион-8-трансферазы в объектах исследования
3.8.2.1. Определение активности глутатион-8-трансферазы в
гомогенате тканей
3.8.2.2. Определение активности глутатион-8-трансферазы в суспензии опухолевых клеток
3.9. Анализ клеточного цикла опухолевых клеток методом проточной
цитофлуориметрии
3.10. «Реал-тайм» ПЦР-метод количественной оценки мРНК исследуемых генов
3.10.1. Сущность метода
3.10.2. Этапы выявления мРНК исследуемого гена
3.10.3. Достоинства и особенности метода РТ-ПЦР
3.10.4. Схема эксперимента
3.11. Статистическая обработка результатов
4. Материалы собственных экспериментальных исследований
4.1. Механизмы цитостатической активности гестагенов
4.1.1. Цитостатическая активность гестагенов в культурах клеток. Концентрационная и временная зависимости
4.1.2. Анализ специфических участков связывания 3Н-прогестерона (3Н-Р4) и относительной связывающей способности (ИВА) исследуемых гестагенов со специфическими участками связывания прогестерона в опухолевых клетках
4.1.3. Оценка влияния гестагенов на уровень экспрессии подтипов ЭР и ПР в опухолевых клетках
4.1.3.1. Влияние гестагенов на уровень экспрессии подтипов ПР
4.1.3.2. Влияние гестагенов на уровень экспрессии подтипов ЭР
4.1.3.3. Влияние гестагенов в концентрации 10-9М на уровень
экспрессии подтипов ЭР и ПР в опухолевых клетках
4.1.4. Влияние гестагенов на уровень экспрессии белков-модуляторов 112 апоптоза в опухолевых клетках
4.1.5. Влияние гестагенов на клеточный цикл опухолевых клеток
4.1.6. Противоопухолевая активность новых гестагенов. 116 Противоопухолевая активность бутерола и мецигестона на перевиваемом мышам раке шейки матки РШМ-
4.1.7. Влияние гестагенов на жизнеспособность фибробластов кожи 118 крыс
4.1.8. Влияние гестагенов на жизнеспособность стромальных клеток 119 человека
4.1.9. Обсуждение полученных результатов
4.2. Механизмы химиосенсибилизационной активности гестагенов
4.2.1. Комбинированное действие доксорубицина и гестагенов на 129 опухолевые клетки
4.2.1.1. Концентрационная и временная зависимости цитостатического 129 действия доксорубицина на культурах клеток
4.2.1.2. Концентрационная и временная зависимости цитостатического 132 действия доксорубицина и гестагенов на опухолевые клетки
4.2.2. Влияние гестагенов в комбинации с этопозидом на 141 жизнеспособность опухолевых клеток MCF-7, Heia
4.2.3. Химиосенсибилизирующая активность бутерола на 144 перевиваемом остром лейкозе мыши Р388, резистентном к винкристину
4.2.4. Влияние гестагенов на транспортную функцию Р-гликопротеина 145 в опухолевых клетках
4.2.5. Влияние гестагенов на аккумуляцию доксорубицина в 150 опухолевых клетках
4.2.6. Влияние гестагенов на активность глутатион-8-трансферазы
4.2.7. Влияние гестагенов на экспрессию мРНК Р-гликопротеина в 154 опухолевых клетках
4.2.8. Влияние гестагенов на экспрессию мРНК MRP-белка в 156 опухолевых клетках
4.2.9. Влияние гестагенов на экспрессию BCRP-белка в клетках MCF-7
4.2.10. Влияние гестагенов в комбинации с доксорубицином на 160 клеточный цикл опухолевых клеток
4.2.11. Обсуждение полученных результатов
4.3. Влияние гестагенов на митохондриальную пору (МТП)
4.3.1. Влияние прогестерона и его аналогов на мембранный потенциал
и кальциевую емкость митохондрий

железы к таким препаратам, как 5-фторурацил, цитоксан, доксорубицин, таксол, винорелбин и другим [Roskoski et al., 2004; Chen et ah, 2010].
При опухолевом росте обнаруживается не только резистентность к химиотерапии, но и резистентность к апоптозу, проявляющаяся в угнетении процессов, вызывающих апоптоз раковых клеток. Часто резистентность к апоптозу связана с мутациями в белке Р-53 (60% случаев). Р-53 - ядерный проапоптотический белок, "защитник" генома: при возникновении мутаций в геноме происходит его активация, что ведет к направленному апоптозу клеток с поврежденной ДНК. Если в белке Р-53 возникает мутация, его защитная функция теряется. Мутации в белке Р-53 ведут к его инактивации и к повышению экспресии Р-гп [Xue et al, 2007, Chen et al, 2010]. При опухолевом росте резко возрастает экспрессия антиапоптотического белка Вс1-2, противоположного по функции белку Р-53 [Wang et ah, 1999]. Показано, что гиперэкспрессия Вс1-2 обусловливает лекарственную устойчивость опухолевых клеток к различным химиотерапевтическим препаратам [Dive, 1997; Калинина Е.В., 2001].
Между экспрессией белков Р-53 и Вс1-2 существует обратная зависимость. Обратная зависимость существует также между экспрессией Р-гликопротеина и белка Вс1-2, что было продемонстрировано при анализе 218 биопсий пациенток с раком молочной железы [Charpin et ah, 1997]. В другом исследовании, которое проводилось в течение 7 лет на 143 пациентках с раком молочной железы [Bottini et ah, 2000], было доказано, что чувствительность опухоли к химиотерапии напрямую зависит от способности раковых клеток подвергаться апоптозу. При этом значимость мутантного белка Р-53 в предотвращении апоптоза была выше у пациентов, принимавших только цитостатики, в отличие от пациентов, принимавших цитостатики совместно с антиэстрогенными препаратами (тамоксифеном). Полученные данные позволили авторам сделать вывод о том, что негативное влияние мутантного белка Р-53 на процессы апоптоза можно устранить фармакологически [Bottini et ah, 2000, Bottini et al, 2003].