Роль внутриклеточных газовых трансмиттеров в молекулярных механизмах реализации апоптоза опухолевых клеток крови

• Автор: Таширева, Любовь Александровна
• Шифр специальности: 14.03.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Томск
• Количество страниц: 171 с. : 7 ил.

Введение
Глава 1.
1.1.
1.1.1.
1.1.2.
1.1.3.
1.1.4. 1.2.
1.2.1.
1.2.2.
1.2.3.
Глава 2. 2.1. 2.1.1 2.2. 2.2.1. 2.2.2.
2.2.3.
2.2.4.
2.2.5.
2.2.6. 2.2.7.
2.2.8.
2.2.9.
Оглавление

Обзор литературы
Газовые трансмиттеры как регуляторы клеточных
функций
Оксид азота: физико-химические свойства,
продукция и эффекты в организме
Сульфид водорода: физико-химические свойства, .
продукция и эффекты в организме
Монооксид углерода: физико-химические свойства,
продукция и эффекты в организме
Внутриклеточные газы - регуляторы апоптоза
Молекулярные механизмы апоптоза
МАРК (митоген-активируемые протеинкиназы) каскады в трансдукции сигнала апоптоза Белки - регуляторы апоптотического процесса
Нарушения апоптоза и внутриклеточной газовой коммуникации при опухолевом росте Заключение
Материал и методы исследования
Материал исследования
Экспериментальный блок исследования
Методы исследования
Культивирование клеточной линии Jurkat in vitro
Выделение и культивирование мононуклеарных
лейкоцитов крови
Оценка количества апоптогически и некротически измененных клеток линии Іигкаї и мононуклеарных
лейкоцитов крови с использованием метода проточной лазерной цитофлуориметрии Оценка митохондриального трансмембранного
потенциала мононуклеарных лейкоцитов крови Оценка количества Т№[11 -позитивных клеток линии Іигкаї и мононуклеарных лейкоцитов крови Оценка продукции ТОТ-а клетками линии Лигкаї и мононуклерными лейкоцитами крови Оценка уровня мРНК генов белков-ингибиторов каспаз и белков-регуляторов апоптоза в клетках 59 линии Іигкаї и мононуклеарных лейкоцитах крови Спектрофотометрическое определение активности каспаз-3 и -9 в клетках линии Іигкаї и
мононуклеарных лейкоцитах крови
Оценка уровня белков-ингибиторов каспаз и

2.2.10.
Глава
3.1.1.
3.1.2.
3.1.3.
3.1.4.
3.1.5
3.1.7.
3.1.8.
3.2.
белков-регуляторов апоптоза в клетках линии Jurkat и мононуклеарных лейкоцитах крови Статистический анализ результатов
Результаты собственных исследований
Особенности реализации программированной гибели клеток в условиях изменения
внутриклеточной концентрации оксида азота Определение дозы и времени воздействия доноров оксида азота, индуцирующих модуляцию апоптоза 67 клеток
Закономерности вовлеченности р38 МАРК в регуляцию апоптотической реакции клеток при
изменении внутриклеточной концентрации оксида азота
Особенности изменения митохондриального трансмембранного потенциала при модуляции внутриклеточной концентрации оксида азота ив
условиях выключения р38 МАРК-зависимых
механизмов
Особенности изменения содержания белков семейства Вс1-2 при изменении внутриклеточной
концентрации оксида азота и выключении р38
МАРК-зависимых механизмов
Особенности экспрессии генов белков-регуляторов апоптоза при изменении внутриклеточной
концентрации оксида азота и выключении р38
МАРК-зависимых механизмов
Особенности экспрессии генов и содержания
соответствующих белков-ингибиторов каспаз при изменении внутриклеточной концентрации оксида
азота и выключении р38 МАРК-зависимых
механизмов
Особенности активности каспаз-3 и -9 при изменении внутриклеточной концентрации оксида
азота и выключении р38 МАРК-зависимых
механизмов
Оценка количества клеток, экспрессирующих TNFR1, и уровня TNFa в супернатантах культур клеток при изменении внутриклеточной
концентрации оксида азота и выключении р38
МАРК-зависимых механизмов
Особенности реализации программированной гибели клеток линии Jurkat в условиях воздействия
донора сульфида водорода in vitro

3.2.1.
3.2.2.
3.2.3.
3.2.4.

3.2.6.
3.2.7.
3.2.8.
3.3.
3.3.1.
3.3.2.
3.3.3.
Определение дозы и времени воздействия донора сульфида водорода, необходимых для изменения 95 апоптоза клеток
Изучение вовлеченности р38 МАРК в регуляцию апоптотической реакции при изменении
внутриклеточной концентрации сульфида водорода Особенности митохондриального
трансмембранного потенциала при изменении внутриклеточной концентрации сульфида водорода и выклЕочении р38 МАРК-зависимых механизмов Оценка содержания белков-регуляторов апоптоза, функционирующих па уровне митохондрий при изменении внутриклеточной концентрации
сульфида водорода и выключении р38 МАРК-зависимых механизмов
Особенности экспрессии мРНК белков-регуляторов апоптоза, функционирующих на уровне митохондрий при изменении внутриклеточной
концентрации сульфида водорода и выключении
р38 МАРК-зависимых механизмов Оценка экспрессии генов и содержания, кодируемых ими белков-ингибиторов каспаз при изменении внутриклеточной концентрации
сульфида водорода и выключении р38 МАРК-зависимых механизмов
Оценка активности каспаз-3 и -9 при изменении внутриклеточной концентрации сульфида водорода 107 и выключении р38 МАРК-зависимых механизмов Оценка количества клеток, экспрессирующих TNFR1, и уровня TNFa в супернатантах культур клеток при изменении внутриклеточной 109 концентрации сульфида водорода и выключении р38 МАРК-зависимых механизмов Особенности реализации программированной гибели клеток линии Jurkat в условиях воздействия
донора монооксида углерода In vitro Определение дозы и времени воздействия донора монооксида углерода, способной модулировать
апоптоз клеток
Изучение вовлеченности р38 МАРК в регуляцию апоптотической реакции при изменении
внутриклеточной концентрации монооксида углерода
Особенности митохондриального
трансмембранного потенциала при изменении

Антагонизм различных путей трансдукции сигнала является основным регулирующим механизмом в клетках. Пути, ведущие к активации ERK и JNK, состоят из нескольких компонентов, большинство из которых регулируются фосфорилированием белка. Активация JNK и р38 МАР-киназы, по-видимому, противоположна активации ERK, и динамический баланс между увеличением активированных ERK и стресс-активированпых JNK-p38 MAP-киназ считается важным в определении выживет клетка или погибнет за счет апоптоза [Опо К., 2000].
Основными мишенями МАРК являются транскрипционные факторы, изменяющие в клетках экспрессию генов. Показано, что JNK/SAPK фосфорилируют факторы семейства Jun [Delaney J., 2008]. Данные факторы способны гетеродимеризоваться с белками FOS, образуя комплексы, регулирующие транскрипцию многих генов [Dickinson R.J., Keyse S.M., 2006]. Кроме того, МАРК рЗ8 фосфорилирует и усиливает активность транскрипционного фактора MEF2C и других белков этого семейства [Johnson G.L., 2007]. Киназа р38 является редокс-регулируемым элементом сигнальных путей и активирует NF-кВ. Она функционирует как регулятор экспрессии МАО (моноаминооксидаза) в апоптотических клетках, участвует в стабилизации мРНК МАО [Brancho D., 2003].
Существует достаточно большое количество транскрипционных факторов, фосфорилируемых МАРК. К ним относят C-jun, ATF2, Elk-1, Р53, NF AT, с-Мус и др. [Delaney J., 2008]. Существуют данные о том, что МАРК могут регулировать экспрессию генов и на посттранскрипционном уровне. Так, в активированных Т-лимфоцитах JNK участвует в стабилизации мРНК интерлейкина 2 (IL- 2) [Hochedlinger K. et al. 2002]. Имеются данные, что МАРК вовлечены также в контроль процесса трансляции.
Активаторами JNK и р38 являются цитокины, АФК, ультрафиолетовое излучение, ингибиторы синтеза белка и другие стрессовые воздействия [Broom O.J., 2009]. Большинство этих факторов активируют