Молекулярные механизмы регуляторного влияния белков теплового шока на апоптоз опухолевых клеток

• Автор: Кайгородова, Евгения Викторовна
• Шифр специальности: 14.03.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Томск
• Количество страниц: 222 с. : 34 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. Современные представления о молекулярных механизмах регуляции апоптоза: роль белков теплового шока (обзор литературы)

ЕЕ Сигналпередающие пути апоптоза в клетке

1.2. Белки теплового шока: классификация и функции

1.2.1. Семейство белков теплового шока 90 кДа

1.2.2. Семейство белков теплового шока 70 кДа

1.2.3. Семейство белков теплового шока 60 кДа

1.2.4. Семейство низкомолекулярных белков теплового шока

1.3. Белки теплового шока и апоптоз: молекулярные механизмы

взаимоотношения
1. 4. Белки теплового шока и опухолевые заболевания
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования
2.1. Общая характеристика исследуемого материала
2.1.1. Характеристика опухолевых клеток линии Jurkat
2.1.2. Характеристика опухолевых клеток линии ТНР-
2.2. Методы исследования
2.2.1. Выделение мононуклеарных лейкоцитов крови
2.2.2. Культивирование опухолевых клеток линий ТНР-1, Jurkat и мононуклеарных лейкоцитов периферической крови
2.2.3. Культивирование опухолевых клеток с ингибиторами белков теплового шока Hsp90 и Hsp
2.2.4. Культивирование клеток с индукторами апоптоза
2.2.5. Оценка реализации апоптоза опухолевых клеток линий ТНР-1, Jurkat и мононуклеарных лейкоцитов крови в аннексиновом тесте методом флуоресцентной микроскопии
2.2.6. Оценка активности каспазы 8 и 3 в опухолевых клетках
2.2.7.0пределене активных форм каспаз-8 и -3 методом
иммуноферментного анализа

2.2.8. Оценка изменения трансмембранного потенциала митохондрий
методом проточной лазерной цитометрии
2.2.9.Определение содержания белков семейства Bcl-2, Р53, NF-kB, белков теплового шока (Hsp90, Нэр27)и их фосфорилированных форм методом вестерн-бл оттинга
2.2.10. Оценка экспрессии генов (уровня мРНК) белков теплового шока Hsp27 и Hsp90 в опухолевых клетках линий Jurkat, ТНР-1 и мононуклеарных лейкоцитах крови
2.2.11. Определение количества TNF-Rl-презентирующих клеток методом проточной цитометрии
2.2.12. Оценка продукции TNFa в супернатантах клеток методом иммуноферментного анализа
2.2.13. Определение уровня sTNF-Rl (растворимая форма TNF-R1) в супернатантах клеток методом иммуноферментного анализа
2.2.14. Оценка экспрессии FasR и FasL на поверхности клеток методом проточной цитометрии
2.2.15. Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. Особенности экспрессии генов и фосфорилированного статуса белков теплового шока (Hsp90 и Hsp 27) в опухолевых клетках
ГЛАВА 4. Роль белков теплового шока (Hsp90 и Hsp 27) в регуляции рецепторного пути апоптоза опухолевых клеток
ГЛАВА 5. Роль белков теплового шока (Hsp90 и Hsp 27) в регуляции митохондриального пути апоптоза
ГЛАВА 6. Шапероны (Hsp90, Hsp 27) и белок Р53: молекулярные основы взаимоотношения
ГЛАВА 7. Роль белков теплового шока в регуляции NF-кВ сигнального пути
ГЛАВА 8. Молекулярные механизмы дизрегуляции апоптоза опухолевых клеток в условиях селективного ингибирования Hsp90 и Hsp 27 in vitro
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АФК - активные формы кислорода
ПКГ - программированная клеточная гибель
МНЛ - мононуклеарные лейкоциты
ФС - фосфатидилсерин
17-AAG - 17-аллиламино-17-гельданамицин
ADAM (A Disintegrin And Metalloproteinase) - семейство белковых металлопротеиназ
AIF (apoptosis inducing factor) - апоптозиндуцирующий фактора Akt - серин-треониновая киназа
АкЪЕКВ - серин-треониновая киназа/протеинкиназа В
ANT (adenine nucleotide translocator) - адениннуклеотид- транслоказа
API (activator protein-1 transcription factor) - активатор транскрипционного
фактора
Apaf-1 (apoptosis protease activating factor) - фактор активации протеаз ASK-1 (Apoptosis Signal-Regulating Kinase 1) - апоптотическая сигнал -регулирующая киназа
Bcl-2 (В-cell leukaemia-2) - белки-регуляторы апоптоза
CAD (caspase-activated DNAase) - ДНКаза, активируемая каспазой
CARD (caspase activation and recruitment domain) - домен активации и
мобилизации каспазы
Cdc37 - ко-шаперон Hsp
c-IAP - ингибитор (специфических протеиназ) апоптоза
CRD (cystein rich domain) - богатый цистеином домен
CsA (Cyclosporine А) - циклоспорин А
Cyp-D (cyclophilin D) - циклофилин D
DD (death domain) - домен смерти
DED (death-effector domain) - домен эффектора смерти

спиралью; С-терминальный домен состоит из небольших перемежающихся а/р-участков (рис.2) [Pearl LH., Prodromou С., 2006]. N-домен присоединён к М- и С-областям так называемым «заряженным линкером» («charged linker»), являющимся вариабельным как по составу, так и по длине у различных видов изоформ белка [Goloubinoff P., De Los Rios P., 2007; Wandinger SK. et al., 2008; Крупская И.В., 2010].
Нвр90-белки в апоформе образуют У-образные димеры за счет межсубъединичных контактов С-доменов. Связывание АТФ приводит к сближению субъединиц и возникновению контакта между М-доменами с образованием закрытой формы шаперона. АДФ-форма Нэр90 представляет собой «полураскрытый» У-димер. Внутри димера Нэр90 на Ы- и С-терминальных доменах выделяют пространство, участвующее в субстратном связывании (рис.2). В аллостерические междоменные взаимодействия в шапероне вовлечены специфические куполоподобные фрагменты структуры — «крышки», локализованные в Ы-доменах и прикрывающие центры связывания АТФ, а также каталитические петли М-доменов. Регуляция функциональной активности Нэр90 осуществляется с помощью набора кошаперонов, которые могут связываться с разными доменами Нзр
АТФ-связывающий
участок
N-концевой
АТФ-связывающий
домен
(a/ß-сендвич)
С-терминальный дог (a/ß-участки)
Сайты связывания с субстратными белками
М-домен (большой и малый aßa-домен)
Рис.2. Строение V-образного димера Hsp
[по данным D.E. Dollins et al., 2008]