Механизмы протеинкиназной регуляции нейрональных калиевых каналов и глутаматных транспортёров, роль нейростероидов при шизофрении

• Автор: Федоренко, Ольга Юрьевна
• Шифр специальности: 14.03.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Томск
• Количество страниц: 256 с. : 13 ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ ПРОТЕИНКИНАЗНЫХ И НЕЙРОСТЕРОИДНЫХ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ ПРИ ШИЗОФРЕНИИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
1.1. Регуляция нейрональных калиевых Ку7/КСЛС) каналов: структурные элементы, функциональное значение, особенности функционирования и связь с дофаминергической нейротрансмиссией
1.2. Регуляция нейрональных глутаматных транспортёров ЕААС1/ЕААТЗ: экспрессия в мозге, молекулярная структура и топология, функционирование, участие в захвате глутамата
1.3. Регуляция ионных транспортных белков мембранными фосфоинозитидами: метаболизм, пространственное распределение и физиологическая роль мембранных фосфоинозитидов;
специфичность Р1Р2 сигнальных путей; контроль фосфоинозитидами функционирования калиевых КСИС) каналов; физиологическая роль РІР5К2А

1. 4. Хепория Ьаеуія ооциты как экспрессирующая модель

1.5. Нейротрансмиттерные гипотезы и роль нейростероидов в

патофизиологических процессах при шизофрении: краткое

изложение биологических теорий развития шизофрении; дофаминергический глутаматергический дисбаланс при
шизофрении; регуляторные функции нейростероидов; участие нейростероидов в патофизиологических процессах при
шизофрении
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2. 1. Характеристика клинического материала

2. 2. Лабораторные методы исследования пациентов и здоровых лиц
2. 2. 1. Выделение ДНК из крови фенольным методом
2. 2. 2. Генотипирование
2. 2. 3. Определение концентрации кортизола в сыворотке крови
2. 2. 4. Определение концентрации ДГЭАС в сыворотке крови
2. 3. Характеристика экспериментального материала
2. 4. Молекулярно-биологические методы
2.4. 1. Молекулярный дизайн эксперимента
2. 4. 2. Векторы
2.4.3. Heat shock трансформация компетентных бактерий
плазмидной ДНК
2. 4. 4. Выделение плазмидной ДНК из бактериальной культуры
набором QIAprep Sin Miniprep Kit (Qiagen)
2. 4. 5. Получение плазмидной ДНК из бактериальной культуры
набором Qiagen Plasmid Midi Kit (Qiagen)
2. 4. 6. Линеаризация ДНК рестрикционными ферментами NEB
(New England BioLabs)
2. 4. 7. Очистка линеаризованной ДНК набором Gel extraction kit
2. 4. 8. Синтез РНК in vitro
2. 4. 9. Измерение концентрации нуклеиновых кислот
2. 4. 10. Агарозный гель электрофорез
2. 4. 11. Молекулярно-биологические характеристики клонов,
использованных в диссертационной работе
2. 4. 12. Биотинилирование белков клеточной поверхности Xenopus
laevis ооцитов с помощью конканавалина А
2. 4. 13. Биотинилирование белков клеточной поверхности НЕК
клеток с помощью конканавалина А
2. 4. 14. Гель электрофорез и Western blotting
2. 4. 15. Иммуноцитохимия

2.4. 16. Приготовление Xenopus laevis ооцитов
2. 4. 17. Микроинъекции кРНК
2. 5. Метод фиксированного потенциала (Voltage Clamp)
2. 6. Статистические методы
Глава 3. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АССАМБЛЕЯ KCNQ4 С KCNE-ß-
СУБЪЕДИНИЦАМИ В XENOPUS LAE VIS ООЦИТАХ
3.1. Влияние различных изоформ KCNE ß-субъединиц на активность KCNQ4 калиевых каналов
3. 2. Модулирование относительной селективности KCNQ4 каналов в отношении моновалентных ионов различными изоформами KCNE ß-субъединиц
Глава 4. ВЛИЯНИЕ НАТИВНОЙ PIP5K2A И МУТАНТНОЙ, АССОЦИИРОВАННОЙ С ШИЗОФРЕНИЕЙ (N251 S)-PIP5K2A НА АКТИВНОСТЬ НЕЙРОНАЛЬНЫХ KCNQ КАНАЛОВ
4. 1. Активность нейрональных гомомерных KCNQ2 и KCNQ5 калиевых каналов при коэкспрессии с нативной нейрональной PIP5K2A
4.2. Модулирование активности нейрональных гетеромерных KCNQ2/KCNQ3 и KCNQ3/KCNQ5 калиевых каналов нативной нейрональной PIP5K2A киназой
4.3. Функционирование нейрональных гетеромерных KCNQ2/KCNQ3 и KCNQ3/KCNQ5 калиевых каналов после воздействия Р1(4,5)Рг
4.4. Влияние мутантной, ассоциированной с шизофренией (N251S)-PIP5K2A на нейрональные гомомерные KCNQ2 и KCNQ5 калиевые каналы
4.5. Воздействие мутантной, ассоциированной с шизофренией (N251 S)-PIP5K2A на нейрональные гетеромерные KCNQ2/KCNQ
и KCNQ3/KCNQ5 калиевые каналы

гиперстимуляции. Поэтому захват глутамата из синаптического пространства играет ключевую роль в поддержании эффективности возбуждающей трансмиссии [Benjamin A. М., Quastei J. H., 1975; Nedergaard М. et al., 2002].
На самом деле, захват глутамата может быть вовлечён не только в удаление избыточного глутамата из синапса, обеспечивая доступ нейротрансмиттера нервному окончанию или предотвращая возможные возбудимотоксические процессы, но также в ограничении рецепторной десенситизации. Поэтому передача сигнальных молекул вероятнее всего связана с быстрым оборотом глутамата на рецепторном уровне, чем с продолжительным нарастанием концентрации нейротрансмиттера в синаптическом пространстве [Nieoullon A. et. al., 2006].
Астроциты и нейроны экспрессируют пять изоформ высокоаффинного, натрийзависимого возбуждающего аминокислотного транспортёра ЕААТ: ЕААС1 (ЕААТЗ), GLT1 (ЕААТ2), GLAST (ЕААТ1), ЕААТ4 и ЕААТ5 [Anderson С. М., Swanson R. А., 2000; GadeaA., Lopez-Colome А. М., 2001; Danbolt N. С., 2001].
Стоит отметить, что по крайней мере в гиппокампусе и коре головного мозга захват глутамата является прежде всего нейрональным, так как в этих районах мозга много синапсов, не окруженных астроцитными отростками [Bergles D. E. et al., 1999].
Многочисленные современные исследования сосредоточились на изучении тонкой молекулярной настройки нейрональных транспортных систем, особенно ЕААС1/ЕААТЗ, которая связана либо с нейрональной активностью, либо с селективной стимуляцией постсинаптических сигнальных путей посредством посттрансляционных механизмов, что подчёркивает динамический характер процессов нейронального захвата. Более того, так как локализация транспортёра на мембране не ограничена синапсом, ЕААС1/ЕААТЗ может быть вовлечён в комплементарные функции независимо от захвата ЕАА из синаптического пространства.