Молекулярно-биологические характеристики мышиного перевиваемого миелопролиферативного заболевания

• Автор: Бигильдеев, Алексей Евгеньевич
• Шифр специальности: 14.01.21
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 180 с. : ил.

Оглавление.
ОГЛАВЛЕНИЕ

ОСНОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Цель работы

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ

Научная новизна и практическое значение работы

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основные положения, выносимые на защиту

Содержание работы по главам

Благодарности
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Модельные системы для изучения лейкозов
Чистые лабораторные линии мышей
Перевиваемые спонтанные модели
Вирусные модели
Иммунодефицитные мыши
Трансгенные мыши
Свойства Г-КСФ
Осложнения, возникающие при применении г-КСФ .•
Лейкозные стволовые КЛЕТКИ
Гипотеза происхождения ИСК из СКК
Гипотеза происхождения ИСК из коммитированных СКК
Гипотеза происхождения JICK из коммитированных клеток-предшественников
Опухоли, заселяющие печень
Гены, выявленные в исследовании: их свойства и функции
Факторы транскрипции
Некоторые поверхностные антигены
Хемокины и их рецепторы
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Получение и ведение перевиваемого заболевания
Приготовление мазков крови
Приготовление отпечатков печени и КМ
приготовление гистологических срезов печени и селезёнки
Выделение клеток костного мозга
Лизис эритроцитов в клетках КМ
Выделение клеток печени
Цитофлуориметрический анализ
Получение библиотек генов, дифференциально экспрессирующихся в клетках лейкозного и
нормального костного мозга
Сортировка клеточных популяций с помощью системы магнитной сепарации MACS
ОПРЕДЕЛЕН1 IE СКОРОСТИ ДЕЛЕНИЯ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК
Введение сингенным реципиентам лимитирующих разведений клеток костного мозга и печени
БОЛЬНЫХ МЫШЕЙ
Выделение ДНК из клеток
Выделение РНК из клеток
Оценка чистоты и качества выделенной РНК
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Разработка праймеров
Построение первых цепей ДНК на РНК (обратная транскрипция)
Постановка ПЦР
Гель-электрофорез в агарозном геле
Нормализация результатов ПЦР по экспрессии генов домашнего хозяйства
Сравнение экспрессии генов в клетках костного мозга и печени больных и здоровых мышей.

ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ
Разработка праймеров и зондов
Постановка ПЦР-РВ
Метод сравнения экспрессии генов «ААС,»
Сравнение экспрессии генов с помощью ПЦР-ппаншета
Определение амплификации гена Мус
Секвенирование ПЦР-фрагментов
Секвенирование участка гена р
Секвенирование участка гена Ся/Зг (рецептор Г-КСФ)
Исследование динамики заселения печени опухолевыми клетками
Выделение 0045+ и СИ45- клеточных популяций из печени животных
Анализ колоний в селезенке (КОЕс)
Получение колоний в полужидкой среде (КОЕк)
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
История выявления заболевания
доказательства не вирусного, а клеточного переноса заболевания
Роль рецептора Г-КСФ в развитии заболевания
морфологические характеристики заболевания
ДИНАМИКА клеточного состава крови при развитии заболевания
Сравнение поверхностного фенотипа клеток костного мозга больных и здоровых мышей
Сравнение экспрессии генов в костном мозге болы плх и здоровых мышей
Описание двух подходов для выбора генов, участвующих в развитии лейкоза
Результаты вычитаюи^ей гибридизации
Гены, не выявленные вычитающей гибридизацией, но, возможно, играющие роль в развитии
исследуемого заболевания
Динамика изменения экспрессии некоторых генов в км
Выводы по анализу экспрессии генов в пораженном КМ
Сравнение содержания кроветворных предшественников (КОЕ-с, КОЕ-к) в костном мозге больных
и здоровых МЫШЕЙ
Клеточные популяции, переносящие заболевание
Изменение средней продолжительности жизни мышей при введении разных популяций клеток
костного мозга
Концентрация ИСК в костном мозге больных мышей
Оценка скорости деления опухолевых клеток
Развитие заболевания в печени
Поверхностный фенотип клеток в печени больных мышей
Динамика заселения печени опухолевыми клетками
Концентрация ЛСК в клетках печени мышей при терминальной стадии заболевания
Сравнение экспрессии генов в печени больных и здоровых мышей
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В РАБОТЕ ОПИСАНА УНИКАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ ПЕРЕВИВАЕМОГО ЛЕЙКОЗА. ОПИСАННОЕ ЗАБОЛЕВАНИЕ ОТЛИЧАЕТСЯ ГЕТЕРОГЕННОСТЬЮ ПОПУЛЯЦИИ ЛСК, ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫМ ЗАСЕЛЕНИЕМ ЛСК ПЕЧЕНИ И ОДНОВРЕМЕННОЙ АКТИВАЦИЕЙ БОЛЬШОГО КОЛИЧЕСТВА ОНКОГЕНОВ И ИХ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ
Исследование костного мозга
Исследование периферической крови
Анализ заселения печени опухолевыми клетками
Динамика заселения печени лейкозньши клетками
Анализ экспрессии генов в СВ45 >- клетках печени терминально больных животных
Клеточные популяции опухоли
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ
ПРИЛОЖЕНИЕ

Основные обозначения и сокращения
АТФ - аденозин трифосфат
АФК - активные формы кислорода
БСА - бычий сывороточный альбумин
Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор
ГМП - гранулоцитарно-макрофагальный предшественник
ГТФ - гуанидин трифосфат
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДР - денатурирующий раствор
ДЭПК - диэтилпирокарбонат
ИЛ - интерлейкин
кДНК - комплементарная ДНК
КМ - костный мозг
КОЕ-к - колониеобразующая единица в культуре
КОЕ-с - колоннеобразующая единица в селезенке
ЛСК - лейкозная стволовая клетка
ЛПС - лииополисахариды
МДС - миелодиспластический синдром
М-КСФ — макрофатальный колониестимулирующый фактор
МПП - мультипотентный предшественник
мРНК - матричная РНК
НК-клетки - натуральные киллеры
НК-гены - гены «домашнего хозяйства»
ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз
ОЛП - общий лимфоидный предшественник
ОМ Л - острый миелоидный лейкоз
ОТ-ПЦР - обратная транскрипция с последующей ПЦР
ПК - периферическая кровь
Пре-В-ОЛЛ - пре-В клеточный ОЛЛ
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени РНК - рибонуклеиновая кислота рРНК - рибосомная РНК
Для выяснения механизма лейкозогенеза была предпринята попытка установить функциональную связь между изменением уровня экспрессии различных генов и свойствами опухолевых клеток.