Клиническое течение и эффективность лечения туберкулеза в зависимости от степени цитотоксичности возбудителя

• Автор: БАРНАУЛОВ, АЛЕКСЕЙ ОЛЕГОВИЧ
• Шифр специальности: 14.01.16
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 94 с. : 4 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР

ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2Л. Методы исследования клинической картины и эффективности лечения больных туберкулезом органов
дыхания

2.2. Методы исследования вирулентности МБТ in vitro и других

биологических свойств

Глава 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИРУЛЕНТНЫХ СВОЙСТВ ШТАММОВ МБТ ПО ТЕСТУ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОНОЦИТОПОДОБНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА ЛИНИИ ТНР-1. СООТНОШЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВОЗБУДИТЕЛЯ
Глава 4. ОСОБЕННОСТИ КЛИНИЧЕСКОГО ТЕЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗНОГО ПРОЦЕССА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И ГЕНОТИПА
ВОЗБУДИТЕЛЯ
4.1. Клинико-рентгенологические и лабораторные характеристики туберкулезного процесса в сопоставлении с
цитотоксичностью возбудителя
4.2 Зависимость клинической картины ТОД от жизнеспособности возбудителя
4.3. Зависимость клинической картины и эффективности
лечения ТОД от лекарственной устойчивости возбудителя
4.4. Зависимость клинической картины и эффективности лечения ТОД и генотипа возбудителя
Глава 5. ЗНАЧИМОСТЬ КЛИНИКО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ В КЛИНИЧЕСКОМ ТЕЧЕНИИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗА ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений
БАК - бактериостатическая активность крови
КОЕ - колониеобразующая единица
ЛЧ - лекарственная чувствительность
ЛУ - лекарственная устойчивость
МБТ - микобактерии туберкулеза
МЛУ - множественная лекарственная устойчивость
ПТП - противотуберкулезные препараты
ТОД - туберкулез органов дыхания
Е - этамбутол
Н - изониазид
К -канамицин
Б - стрептомицин
И - рифампицин
ЯЬ - рифабутин
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время изучению вирулентности микобактерий туберкулеза (МВТ) в мировой литературе посвящено большое количество работ. Вирулентность является показателем степени патогенности и определяет характер взаимодействия микроб — хозяин, что представляется особенно актуальным в современной эпидемиологической обстановке. Оценку вирулентности микобактерий проводят с помощью самых разных методов, начиная с молекулярно-генетических и кончая моделями на животных (Джэкобс У.Р., 2002).
В экспериментальных моделях туберкулеза на животных - мышах, морских свинках, кроликах - вирулентность МВТ оценивают по продолжительности жизни зараженных животных и степени бактериальной обсемененности их органов, объему поражений легких (Васильева С.Н. и др, 2003; Smith I., 2003). Преимущество моделей на животных заключается в том, что они позволяют оценить течение процесса на всех его стадиях. К недостаткам можно отнести тот факт, что модели на животных длительны, результаты зависят от индивидуальных особенностей и состояния животных, и потому не позволяют выявить различия в вирулентности достаточно большого числа штаммов МВТ. Кроме того, следует отметить, что нельзя в полной мере экстраполировать на человека данные, полученные с помощью животных.
Сложность оценки молекулярно- генетическими методами факторов вирулентности МЕТ определяется генетическими особенностями возбудителя. В отличие от других патогенов, МВТ присуща чрезвычайная генетическая гомогенность: доля идентичных нуклеотидных
последовательностей у видов комплекса достигает 99,9% (Dos Vultos Т. et al., 2008) при весьма разнообразных фенотипических характеристиках. Можно сказать, что разнообразие клинических ответов на инфекцию определяется не

суспензии культур доводили до 5 ед. по стандарту мутности, разводили бульоном Миддлбрука в 10 раз и термостатировали при 37°С в течение 3 суток. Полученную субкультуру вновь обрабатывали ультразвуком, доводили до оптической плотности, равной 0,066 при 600 нм (спектрофотометр "Ultraspect 2000").
В опытах использовали клетки ТНР-1 - человеческой моноцитоподобной клеточной линии. Клетки засевали в питательную среду DMEM/F12 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров (ЭСК) и выращивали при 37°С в 5% С02 (ССЬ -инкубатор МСО 5АС фирмы "Sanyo"). Затем моноциты помещали в 96-луночный планшет для культур клеток, по 50мкл/лунку. Конечное число клеток/лунку - 3x104 . Дифференцировку и адгезию клеток осуществляли форболовым эфиром (PMA, phorbol myristat acetate, Sigma), добавляя его в конечной концентрации 50 нМ в объеме 50 мкл/лунку. Затем клетки инкубировали 48 ч при 37°С в 5% ССЬ, среду меняли на свежую без РМА и культивировали еще 24 ч часа в тех же условиях.
Клетки ТНР-1 заражали штаммами пропорциях: 50:
бактерий/макрофаг. Зараженные клетки инкубировали при 37°С в 5% ССЬ в течение 96 часов. Содержимое лунок в планшетах фиксировали 10% раствором формалина и окрашивали 0,1% раствором генцианвиолета в течение 30 минут, а затем промывали проточной водой в течение 15 минут. После просушки и обработки 0,2% раствором Triton Х-100 (для лизирования клеточных структур и выхода красителя в раствор) супернатант перемещали в чистый 96-луночный планшет для дальнейшей оценки оптической плотности (ОП) в планшетном фотометре (EIA Microwell Reader II, Sigma). Процент гибели инфицированных клеток вычисляли по формуле:
% погибших клеток = (ОП контроля-ОП образца/ ОП контроля)х100%
Цитотоксичность штамма исследовали в сравнении с музейным штаммом H37RV и оценивали: как высокую, если процент гибели макрофагов был достоверно выше, среднюю - при значениях, колеблющихся в пределах