Влияние экспрессии изоформ ядерного рецептора HNF4a на свойства клеток протоковой аденокарциномы поджелудочной железы человека

• Автор: Чесноков, Михаил Сергеевич
• Шифр специальности: 14.01.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 123 с. : 43 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность темы

1.2. Цели и задачи исследования

1.3. Научная новизна и практическая значимость работы

1.4. Основные положения, выносимые на защиту

1.5. Апробация работы

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Канцерогенез и опухолевая прогрессия

2.1.1. Особенности опухолевой клетки

2.1.2. Эпителиально-мезенхимальный переход
2.2. Поджелудочная железа
2.2.1. Поджелудочная железа: строение и функции
2.2.2. Эмбриональное развитие поджелудочной железы
2.2.3. Патологии поджелудочной железы
2.3. Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (ПАКПЖ)
2.3.1. Патогенез и этапы развития ПАКПЖ
2.3.2. Биомаркеры ПАКПЖ
2.4. Основные регуляторы диффсренцировки клеток поджелудочной железы

2.4.2. РТР 1а
2.4.3. Гепатоцитарные ядерные факторы
2.5. Транскрипционный фактор Н1ЧЕ4а
2.5.1. Строение гена НМР4А и его изоформы
2.5.2. Транскрипционная активность НЫБ4а
2.5.3. НЫР4а в развитии и функционировании эпителиальных органов и тканей
2.5.4. Другие представители семейства Н1ЧР4
2.5.5. Механизмы регуляции экспрессии НОТ4а
2.6. Роль Н1ЧЕ4а в канцерогенезе
2.6.1. НЫБ4а в развитии гепатоцеллюлярной карциномы
2.6.2. Н№4а в опухолях других органов
2.7. Заключение обзора литературы

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
ЗЛ. Растворы, среды и реактивы
3.2. Олигонуклеотидные праймеры
3.3. Ферменты
3.4. Плазмидные векторы
3.5. Клеточные линии
3.6. Клинические образцы ткани
3.7. Наращивание и выделение плазмид
3.8. Лентивирусная инфекция клеток линий ПАКПЖ
3.9. Выделение суммарной клеточной РНК
3.10. Обратная транскрипция
3.11. Полимеразная цепная реакция
3.12. Количественная полимеразная цепная реакция с детекцией в реальном времени
3.13. Белковый ДСН-электрофорез в ПААГ
3.14 Электропсрснос белков из ПААГ на PVDF-мсмбрану
3.15. Иммуноблоттинг
3.16. Фиксация клеток
3.17. Иммунофлюоресцентная окраска клеток на HNF4aTOT и Е-кадхерин
3.18. Определение интенсивности синтеза ДНК
3.19. Клоногенный тест
3.20. Измерение кинетики роста клеточных культур in vitro
3.21. Миграционный тест
3.22. Статистическая обработка данных
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Выбор модельной системы для исследования роли изменения экспрессии HNF4a в клетках ПАКПЖ
4.2. Выбор исследуемых тканеспецифических генов, связанных с уровнем дифференцировки и функциями поджелудочной железы
4.3. Характеристика экспрессии генов в культурах клеток ПАКПЖ с различным уровнем дифференцировки
4.4. Исследование влияния экзогенной экспрессии HNF4a на злокачественный
потенциал культур низкодиффереицированных клеток ПАКПЖ Panel и MiaPaCa

4.4.1. Получение клеточных культур Panel и MiaPaCa2, экзогенно экспрессирующих изоформы HNF4al и HNF4a7
4.4.2. Определение уровней экспрессии изоформ и групп изоформ HNF4a в клетках Pancl-FTNF4a и MiaPaCa2-HNF4a
4.4.3. Определение уровней синтеза белка HNF4a в клетках Pancl-HNF4a и MiaPaCa2-HNF4a
4.4.4. Изменения экспрессии тканеспецифических транскрипционных факторов в
клетках Рапс 1 -HNF4a и MiaPaCa2-HNF4a
4.4.5. Изменения экспрессии функциональных панкреатических генов в клетках
Pancl-HNF4a и MiaPaCa2-HNF4a
4.4.6. Влияние экзогенной экспрессии HNF4a на биологические характеристики
клеток Panel и MiaPaCa2
4.4.6.1. Определение скорости роста клеточных культур Pancl-FTNF4a и MiaPaCa2-HNF4a
4.4.6.2. Исследование интенсивности синтеза ДНК в клетках Pancl-HNF4a
и MiaPaCa2-FTNF4a
4.4.6.3. Снижение колониеобразующей способности клеток Panel и MiaPaCa2 при экзогенной экспрессии FTNF4a
4.4.6.4. Усиление способности клеток Pancl-HNF4a и MiaPaCa2-FlNF4a к
направленной миграции
4.5. Исследование влияния подавления синтеза HNF4a на злокачественный потенциал культуры высокодифференцированных клеток ПАКПЖ СаРап2
4.5.1. Получение клеточных культур СаРап2 с подавленным синтезом HNF4a
4.5.2. Определение уровней синтеза белка HNF4a в клетках CaPan2-shlFNF4a
4.5.3. Определение уровней экспрессии изоформ и групп изоформ HNF4a в клетках CaPan2-shHNF4a
4.5.4. Изменения экспрессии тканеспецифических транскрипционных факторов в
клетках CaPan2-shHNF4a
4.5.5. Изменения экспрессии функциональных панкреатических генов в клетках
CaPan2-shHNF4a
4.5.6. Влияние подавления синтеза HNF4a на биологические характеристики клеток CaPan2-shHNF4a
4.5.6.1. Повышение скорости роста клеточных культур CaPan2-shHNF4a
4.5.6.2. Усиление интенсивности синтеза ДНК в клетках CaPan2-shFINF4a

[Jacquemin et ah, 2003; Poll et al., 2006]. На более поздних стадиях развития ПЖ HNF6 осуществляет контроль дифференцировки эндокринных и протоковых клеток [Pierreux et al., 2006; Vanhorenbeeck et ah, 2007]. Подавление экспрессии HNF6 является необходимым условием окончательной дифференцировки эндокринных клеток, в противном случае чувствительность к глюкозе и эффективность секреции инсулина Р-клетками значительно снижаются [Tweedie et al., 2006].
Нокаут HNF6 у мышей приводит к их ранней гибели из-за нарушения работы печени и развития диабета, вызванного недостатком эндокринных клеток ПЖ. При этом функции экзокринной части ПЖ не нарушаются; возможно, потеря функции F1NF6 до некоторой степени компенсируется активностью его паралога ОС-2 [Jacquemin et al., 2000; Vanhorenbeeck et al, 2007]. Тканеспецифический инактивация гена HNF6 в клетках ПЖ сопровождается нарушением формирования протоков, усилением пролиферационной активности протоковых клеток и подавлением экспрессии дифференцировочных маркеров [Zhang et al., 2009].
Предполагается, что нарушение функции FTNF6 может играть важную роль в развитии опухолей ПЖ. Как говорилось выше, его экспрессия характерна для протоковых клеток, опухолевая трансформация которых приводит к возникновению ПАКПЖ. Образцы ткани ПАКПЖ характеризуются пониженными уровнями экспрессии HNF6 и регулируемого им I INF I (1 по сравнению с нормальной тканью ПЖ. Аналогичная закономерность наблюдается в большинстве клеточных линий ПАКПЖ. Экзогенная реэкспрессия HNF6 в клетках Panel сопровождается ослаблением их способности к инвазии и восстановлением экспрессии HNFip [Jiang et al, 2008]. С другой стороны, активация экспрессии HNF6 в дифференцированных ациноцитах ассоциирована с их редифференцировкой по типу протоковых клеток и развитием ацинарно-протоковой метаплазии — одного из типов неизвазивных панкреатических неоплазий [Prcvot et al., 2012].
Семейство С/ЕВР. К семейству С/EBP относят 6 белков (а, р, у, 5, е, Q, для которых характерно наличие «лейциновой застежки», обеспечивающей димеризацию при связывании ДНК [Schrem et al., 2004]. Белки семейства С/EBP могут образовывать гетеродимеры, благодаря чему возможна тонкая регуляция экспрессии генов, содержащих в промоторе С/ЕВР-связывающие элементы. Как правило, С/EBP являются активаторами транскрипции, поскольку все изоформы семейства способны связывать коактиваторы р300/СВР [Mink et al, 1997; Erickson et al, 2001].
В различных тканях транс-активационное действие С/EBP определяется набором экспрессирующихся факторов этого семейства. Так, в нормальных гепатоцитах активны белки С/ЕВРа, С/ЕВРр и С/ЕВР5, регулирующие процессы глюконеогенеза и детоксикации [Schrem et ah, 2004]. В гепатоцитах и во многих других тканях С/ЕВРа и С/ЕВР|3 контролируют процессы