Клиническое и биологическое значение изменения экспрессии гена KISS1 при метастазировании опухолевых клеток рака молочной железы в головной мозг

• Автор: Каверина, Наталья Владимировна
• Шифр специальности: 14.01.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 112 с. : 12 ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АС - астроциты

ВКМ - внеклеточный матрикс

ГЭБ - гемато-энцефалический барьер

дцРНК - двухцепочная молекула РНК

DEPC - диэтилпирокарбонат

ДМСО - диметилсульфоксид

ER - рецепторы эстрадиола

ИФА - иммунофлуоресцентный анализ

ИГХ - иммуногистохимический

ИПР - инвазивный протоковый рак молочной железы

КП - коэффициент пролиферации
ЛГ - лютеинизирущий гормон
МС - клетки микроглии
мРНК - матричная РНК
5-Мес - 5-метилцитозин
МПГМ - метастатическое поражение головного мозга
МРМЖ -церебральные метастазы рака молочной железы
ОТ-ГІЦР - полимеразная цепная реакция с обратной
транкрипцией в реальном времени ПЦР - полимеразная цепная реакция
PR - рецепторы прогестерона
ПКИС - протоковая карцинома in situ
РМЖ - рак молочной железы
sh RNA - короткие шпилечные РНК
ЦНС - центральная нервная система
ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИИ
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Метастатический рак молочной железы
1.2. Гены-супрессоры метастазирования
1.2.1. Открытие KISS1 как гена супрессора метастазирования
1.2.2. Структура кисспептина
1.2.3. Рецептор кисспептина GPR54
1.2.4. Внутриклеточные сигнальные пути, активируемые кисспептинами
1.2.5. Экспрессия KISS1 в опухолях человека
1.3. Метилирование ДНК
1.3.1. Функция метилирования ДНК
1.3.2. Метилирование ДНК в нормальных клетках
1.3.3. Механизмы репрессии транскрипции
1.3.4. Нарушение метилирования в опухолях
1.3.5. Нарушение метилирования при раке молочной железы
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2Л. Материаллы исследования
2.1.1. Клинические образцы
2.1.2. Клеточные линии
2.2. Методы исследований
2.2.1. Технология тканевых матриц

2.2.2. Иммуногистохимический анализ
2.2.3. Иммуноферментный анализ (ELISA)
2.2.4. Выделение ДНК из клеточного материала
2.2.5. Выделение ДНК из тканевых срезов, зафиксированных в парафине
2.2.6. Выделение РНК из клеточных культур
2.2.7. Выделение РНК из парафиновых срезов тканей
2.2.8. Выделение РНК из замороженных срезов тканей
2.2.9. ОТ-ПЦР
2.2.10. Бисульфитная модификация ДНК и ПЦР
2.2.11. Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле
2.2.12. ПЦР в режиме реального времени
2.2.13. Нокдаун экспрессии гена K1SS1 в клетках рака молочной железы с помощью РНК-интерференции, основанной на лентивирусной трансдукции
2.2.14. Оценка пролиферативной активности с помощью МТТ-теста
2.2.15. Анализ миграционной активности контрольных и генетически модифицированных клеток рака молочной железы
2.2.16. Статистический анализ данных
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Анализ экспрессии белка и мРНК гена K1SS1 в клетках РМЖ и церебральных матастазов (МРМЖ), определение взаимосвязи с клинико-морфологическими признаками первичной опухоли рака молочной железы
3.1.1. Иммуногистохимический анализ экспрессии KISS1 гена в клетках морфологически нормальной ткани молочной железы, рака молочной железы и метастазах в головной мозг
3.1.2. Анализ зависимости экспрессии гена KISS1 от стадии рака

данного гена в развитии метастатического РМЖ недостаточно изучена. Анализ уровня мРНК KISS1, выделенной из парафиновых образцов тканей РМЖ II или III стадий заболевания с наличием метастазов в регионарные лимфоузлы, показал, что данный ген экспрессируется только в 3% образцов. Данные результаты подтверждают антиметастатическую роль гена KISS1 [173]. Stark et al. показали, что экспрессия K1SS1 на уровне мРНК часто снижена в образцах церебральных метастазов РМЖ по сравнению с первичной опухолью [115]. Однако, прогностическая значимость гена K1SS1 при данном заболевании остается неизученной.
1.3. Метилирование ДНК
1.3.1. Функции метилирования
Метилирование ДНК - это процесс ковалентного присоединения in vivo метильной группы к цитозиновым остаткам основаниям в составе ДНК, 5-метилцитозин (5-МеС) был первым обнаруженным модифицированным основанием [2,4]. Метилирование оснований геномной ДНК показано у бактерий, растений, животных, в том числе и млекопитающих (включая человека), но отсутствует у дрожжей и нематод [13,15]. Кроме 5-МеС ДНК прокариот содержит модифицированное основание Иб-метиладенин, тогда как ДНК высших эукариот - только 5-МеС [30, 174]. Так как нуклеотидная последовательность при этом не изменяется, то по существу метилирование-это событие эпигенетическое [175, 176]. Самые сложные функции
метилирование ДНК выполняет в клетках млекопитающих, данный механизм вовлечен в такие фундаментальные процессы жизнедеятельности клетки, как регуляция экспрессии генов и поддержание стабильности генома. В первом случае - это стабильная репрессия транскрипции некоторых генов, таких как гены инактивированной Х-хромосомы у самок, импринтированные гены, часть тканеспецифичных генов, во втором - контроль процессов рекомбинации и защита генома от инвазии и распространения чужеродной информации.