Экспрессия и активность белков множественной лекарственной устойчивости опухолей при воздействии ингибитора протеасом бортезомиба

• Автор: Лалетина, Лидия Александровна
• Шифр специальности: 14.01.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 72 с. : 19 ил.

Оглавление

Список сокращений

I. Введение

II. Литературный обзор

II. 1. Устойчивость опухолей к терапии

II. 1.1. Механизмы множественной лекарственной устойчивости (МЛУ)

опухолей. Многофакторная ЛУ

И. 1.2. Основные транспортёры семейства ABC

II.1.3. Экспрессия ABC-транспортеров в опухолях

II. 1.4. Стволовые клетки и ABC-транспортеры

II. 1.5. Регуляция ABC-транспортеров
II. 1.5.1. Регуляция транскрипции генов ABC-транспортеров. Факторы
транскрипции, регулирующие ABC транспортеры
II. 1.5.1.а. Влияние белка р53 на регуляцию транскрипции АВС-
транспортеров
II.1.5.1.6. Влияние белка YB-1 на регуляцию транскрипции ABC
транспортеров
И.1.5.1.в. Роль факторов транскрипции семейства АР-1 в регуляции гена

II. 1.5.2. Регуляция ABC-транспортеров на пост-транскрипционном
уровне
II. 1.5.3. Пути сигнальной трансдукции, вовлеченные в регуляцию АВС-
транспортеров
II. 1. 6. Многофакторная МЛУ. Сигнальный путь PI3K/Akt/PTEN
11.1. 7. Участие систем деградации белков в лекарственной устойчивости опухолей
11.1. 7.1. Протеасома. Её строение и роль в клетке
II. 1. 7.2. Противоопухолевые агенты, действие которых направленно на ингибирование активности протеасом
11.1. 7.3. Бортезомиб и транспортные белки семейства ABC
III. Материалы и методы
111.1. Линии клеток, использованные в работе
111.2. Реагенты, использованные в работе
111.3. Оценка цитотоксичности препаратов - колориметрический метод (МТТ)
111.4. Метод антительного сдвига (UIC2-shift assay или UIC2-OAC)
111.5. Оценка функциональной активности Р-гликопротеина с помощью родамина (Rhl23)
111.6. Иммуноцитохимический анализ белков
111.7. Выделение РНК и ОТ-ПЦР
111.8. Иммуноблотинг
111.9. Иммунноцитохимическое определение внутриклеточной локализации
белка YB-
IV. Результаты
IV-1. Исследование цитотоксического действия бортезомиба на различные линии чувствительных и резистентных к лекарственным препаратам
опухолевых клеток
IV-2. Влияние бортезомиба на функциональную активность и экспрессию
Р-гликопротеина (Pgp)
IV-2.1. Оценка влияния бортезомиба на функциональную активность и экспрессию Р-гликопротеина (Pgp) в клетках K562/LS9 с помощью метода
антительного сдвига (UIC2-shift assay или UIC2-OAC)
IV-2.2. Влияние бортезомиба на выброс родамина 123 клетками K562A-S9..47 IV-3. Влияние бортезомиба на степень чувствительности родительских и
резистентных опухолевых клеток к препаратам круга МЛУ
IV-4. Влияние бортезомиба на экспрессию гена MDR1 и других генов круга
МЛУ в опухолевых клетках разного гистогенеза
IV-4. 1. Базальный уровень экспрессии мРНК генов МЛУ в исследованных клетках
IV-4. 2. Влияние бортезомиба на содержание мРНК генов МЛУ в
исследованных линиях
IV-5. Влияние бортезомиба на количество белков множественной
лекарственной устойчивости в опухолевых клетках
IV-6. Изменения активности киназ Akt и ERK1/2 под влиянием бортезомиба
в лекарственно-устойчивых и родительских клетках
IV-7. Анализ уровня экспрессии генов MDR1 и MRP1 в опухолевых клетках при воздействии на них бортезомиба и Ly 294002 (специфического
ингибитора фосфорилированной формы Akt-киназы)
IV-8. Влияние бортезомиба на фенотип МЛУ при длительном воздействии
препарата на популяции опухолевых клеток
IV-8.1. Сравнение чувствительности к бортезомибу клеток до и после
длительного культивирования в присутствии этого препарата
IV-8.2. Сравнение конститутивной экспрессии фосфорилированной формы киназы Akt в клетках до и после длительного культивирования в
присутствии бортезомиба
IV-8.3. Исследование экспрессии белка Pgp и маркеров стволовых кроветворных клеток CD34 и CD38 в клетках до и после длительного
культивирования в присутствии бортезомиба
IV-9. Роль белка YB-1 в характере ответа опухолевых клеток на
бортезомиб
IV-9.1. Определение влияния бортезомиба на экспрессию мРНК гена YB-1 в
опухолевых клетках
IV-9.2. Исследование влияние бортезомиба на локализацию белка YB-1 в опухолевых клетках
V. Обсуждение результатов
VI. Выводы
VII. Список литературы
III. Материалы и методы

III. 1. Линии клеток, использованные в работе. Линию клеток хронического миелолейкоза человека К562 [56] и ее сублинию, гиперэкспрессирующую Pgp (K562/i-S9) [63] поддерживали на среде RPMI 1640 с 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. Также использована линия клеток острого миелобластного лейкоза KG1 человека [45], пассируемая на среде Iscove's MDM с 10% fcs. Клетки эпидермоидной карциномы полости рта человека КВ 3-1 и клетки сублинии КВ 8-5, гиперэкспрессирующие Pgp, отобранные на резистентность к колхицину [2], клетки MCF-7 - линия клеток аденокарциномы молочной железы человека [86]. Клетки культивировали в среде DMEM с 10% сыворотки. Все клеточные линии культивировали при температуре 37°С в атмосфере 5%

III.2. Реагенты, использованные в работе. Бортезомиб (Velcade; BEN VENUE Laboratories, Inc., США); доксорубицин (Dox; Sigma, США); Винбластин (Vbl; Гедеон Рихтер, Венгрия); Родамин (Rhodamine 123 (Rh 123); Sigma, США); поликлональные кроличьи антитела против белкаYB-1, предоставленные лабораторией JI.П. Овчинникова (Институт белка РАН); моноклональные антитела против актина (MAB1501R ,«Chemicon», США); флуоресцентно меченные вторые антитела к иммуноглобулинам кролика (Alexa Fluor 488 (green) «Invitrogen», США.); вторые антитела к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с пероксидазой (АР160Р «Chemicon», США); поликлональные кроличьи антитела против фосфорилированной АКТ1 (Ser473) (АВ3132 «Chemicon», США), поликлональные кроличьи антитела против MRP1 («Chemicon», США), вторые антитела к иммуноглобулинам кролика, конъюгированные с пероксидазой (АР132Р: «Chemicon», США); антитела против Pgp напрямую