Влияние белка CRABP1 на биологические характеристики трансформированных клеток мезенхимального происхождения, ассоциированные с опухолевой прогрессией

• Автор: Каинов, Ярослав Андреевич
• Шифр специальности: 14.01.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 134 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Список использованных сокращений
ВВЕДЕНИЕ
1. Обзор литературы. Функции белка CRABP1 в норме и при опухолевой трансформации: регуляция метаболизма и биологической активности ретиноевой кислоты
1.1 Введение
1.2 Функции ретиноевой кислоты в организме
1.3 Рецепторы ретиноевой кислоты: RAR- и RXR-белки
1.4 Метаболизм и транспорт ретиноевой кислоты
1.5 Строение и внутриклеточные функции белка CRABP
1.6 Роль CRABP1 в патогенезе промиелоцитарного лейкоза
1.7 Экспрессия CRABP1 в развитии солидных опухолей
1.8 Заключение
2. Материалы и Методы
2.1 Клеточные линии
2.2 Выделение нуклеиновых кислот
2.2.1 Выделение плазмидной ДНК
2.2.2 Выделение РНК из клеточных культур и образцов опухолевых тканей
2.2.3 Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей
2.3 Аналитический электрофорез ДНК в агарозных гелях
2.4 Молекулярное клонирование
2.4.1 Получение компетентных клеток E. coli
2.4.2 Трансформация компетентных клеток E.coli
2.4.3 Обработка ДНК рестрицирующими эндонуклеазами
2.4.4 Реакция лигирования
2.4.5 Клонирование кодирующей последовательности гена с кДНК
2.4.6 Клонирование предшественников малых шпилечных РНК
2.4.7 Сайт-направленный мутагенез
2.5 Обратная транскрипция РНК
2.6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.6.1 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.6.2 ПЦР в реальном времени
2.7 Трансфекция
2.8 Инфекция псевдовирусными частицами
2.9 Анализ белков
2.9.1 Приготовление клеточных лизатов
2.9.2 Вестерн-блот гибридизация
2.9.3 Приготовление образцов для определения ферментативной активности протеиназ
2.9.4 Анализ желатиназной активности
2.9.5 Анализ активности иРА
2.10 Исследование клеточных характеристик in vitro
2.10.1 Анализ динамики роста клеток
2.10.2 Анализ клеточной подвижности методом «зарастания раны» in vitro (wound healing assay)
2.10.3 Тест на образование колоний в условиях разреженной популяции (клоногенность)
2.10.4 Тест на образование колоний в полужидкой среде
2.10.5 Тест на движение по градиенту концентраций факторов роста
2.11 Исследование клеточных характеристик in vivo
2.11.1 Определение туморогенности
2.11.2 Определение экпериментальной (ЭМА) и спонтанной (СМА) метастатической активности
2.12 Характеристика исследованных опухолевых образцов
2.13 Статистическая обработка результатов
2.14 Растворы, реагенты и среды
3. Результаты

3.1. Исследование экспрессии CRABP1 в линиях с различным метастатическим потенциалом
3.2. Получение линии НЕТ-SR с повышенной экспрессией CRABP1
3.3. Изучение туморогенности и СМА линии НЕТ-SR с повышенной экспрессией CRABP1 in vivo
3.4. Получение линии HET-SR1 с подавленной экспрессией CRABP1
3.5. РІзучение характеристик линии HET-SR1 с подавленной экспрессией CRABP1 in vivo
3.6 Исследование характеристик полученных клеточных линий в культуре in vitro
3.6.1 Изучение динамики роста полученных клеточных линий
3.6.2 Анализ способности к колониеобразованию в условиях разреженной популяции (клоногенность)
3.6.3 Исследование способности к колониеобразованию в полужидкой среде
3.6.4 Исследование миграционной активности полученных клеточных линий
3.7 Изучение активности и экспрессии протеаз, разрушающих внеклеточный матрикс
3.8 Изучение экспрессии РК-респонсивых генов и маркеров клеточной дифференцировки
3.9 Получение мутантной формы CRABP1, неспособной связывать РК и изучение ее туморогенности in vivo
3.10 Изучение экспрессии CRABP1 в образцах мезенхимальных опухолей мягких тканей человека
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ

пролиферацию и снижает способность к колониеобразованию опухолевых клеток. При этом наблюдается повышение экспрессии опухолевых супрессоров р21 и р27, играющих важную роль в регуляции клеточного цикла (Tanaka et al. 2007). Снижение экспрессии CRABP1 является фактором неблагоприятного прогноза для больных светклоклеточным и серозным раком яичника (Miyake et al. 2010).
Все вышеперечисленные данные говорят в пользу возможности функционирования белка CRABP1 в качестве опухолевого супрессора, однако именно в последнее время накопилось множество фактов, которые опровергают это предположение. Для ряда новообразований и в некоторых экспериментальных моделях экспрессия CRABP1 не только выражено повышается, но, зачастую, четко кореллирует со злокачественным фенотипом опухоли. Так, уровень продукции этого белка возрастает с увеличением степени трансформированное культур кератиноцитов ротовой полости человека. В условно нормальной культуре кератиноцитов NOK уровень синтеза CRABP1 низок, в то время как продукция его белка-«антагониста» CRABP2 высока. В культуре кератиноцитов, трансформированной Т-антигеном SVpgC2a, а также в ее злокачественной производной - SqCC/Yl, резко возрастает продукция белка CRABP1 на фоне снижения продукции CRABP2 (Dressier et al. 2002). Трансфекция линии NIH-ЗТЗ онкогеном H-ras приводит к увеличению белковой продукции CRABP1 и, как результат, снижению индуцированной РК экспрессии трансглутаминазы С (Kosa et al. 1995). Экспрессия CRABP1 снижает чувствительность к PK-опосредованному ингибированию роста и повышает устойчивость к радиационному воздействию клеток линии плоскоклеточного рака головы и шеи НТВ35 (Blaese et al. 2003).
Для эндометриодного рака яичников характерно более чем стократное повышение количества мРНК CRABP1 (Banz et al. 2010). В аденокарциномах эндометрия экспрессия CRABP1 ассоциирована с высоким уровнем инвазивности, а также низкой степенью дифференцировки клеток опухоли