Динамика формирования межклеточных адгезионных контактов и перестроек актинового цитоскелета нетрансформированных и трансформированных клеток

• Автор: Айолло, Дмитрий Владимирович
• Шифр специальности: 14.01.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 113 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

1. Список сокращений

2. Введение

2.1. Актуальность проблемы

2.2. Цели и задачи работы

2.3. Научная новизнаи практическая значимость работы

3. Обзор литературы

3.1 Кадхерины и их функции в нормальных и трансформированных клетках

3.1.1. Классические кадхерины

3.1.2. Кадхерины других типов

3.1.3. Молекулярная организация кадхерин-содержащих АК

3.1.4. Процесс сборки АК
3.1.5. Нарушения межклеточной адгезии при неопластической трансформации
3.2. Актиновый цитоскелет нормальных и трансформированных клеток
3.2.1 Актиновая сеть клеточного края
3.2.2. Актин-связывающие белки
3.2.3. Стресс-фибриллы
3.2.4. Организация актинового цитоскелета фибробластов
3.2.5. Организация актинового цитоскелета эпителиальных
3.2.6. Участие актинового цитоскелета в построении АК
3.2.7. Изменения актинового цигоскелета при неопластической трансформации.
3.3. Вклад малых ГТФаз семейства IIНо в регуляцию динамики актинового цитоскелета и сборки межклеточных адгезионных контактов
3.3.1. Малые ГТФазы семейства Шго
3.3.2.1?ас
3.3.3. Шго
3.3.4. Роль малых ГТФаз Шго и Вас в формировании АК
3.3.5. Изменение регуляторной функции малых ГТФаз семейства Шго при неопластической трансформации
4. Материалы и методы
4.1. Реагенты
4.2. Клеточные линии и трансфекция
4.3. Анализ формирования межклеточных контактов в узкой ране
4.4. Выделение малых ГТФаз Шго и Яас и их введение в клетки
4.5. РНК интерференция
4.6. Флуоресцентное окрашивание и микроскопия
4.7. Видеосъёмка и анализ видеоизображений
4.8. Вестерн-блоттинг
5. Результаты
5.1. Организация АК и актинового цитоскелета нетрансформированных эпителиоцитов IА11-2 и трансформированных эпителиоцитов IА11
5.2. Анализ динамики Е-кадхерин-содержащих АК
5.2.1. Анализ динамики АК в редкой культуре
5.2.2. Динамика формирования АК при схождении узкой раны
5.2.3. Исследование аккумуляции актина и при формировании АК
5.2.4. Исследование аккумуляции зиксина при формировании АК
5.2.5. Исследование аккумуляции а-актинина при формировании АК трансформированных эпителиоцитов 1А11
5.3 Регуляция формирования АК ^трансформированных и
трансформированных эпителиоцитов малыми ГТФазами семейства Rho
5.3.1 Влияние введения СЗ трансферазы на формирование различных типов АК
5.3.2. Влияние ингибитора ROCK Y-27632 на сборку АК
5.3.3. Действие ингибитора АТФазы миозина блеббистатина на сборку

5.3.4. Количественная оценка влияния Y-27632 и блеббистатина на аккумуляцию кадхерина в АК различных типов клеток
5.3.5. Влияние подавления экспрессии mDial на формирование АК
5.3.6. Влияние введения N17Rac на формирование АК
6. Обсуждение
7. Заключение
8. Выводы
9. Список литературы

1. Список сокращений.
АК - межклеточный адгезионный контакт
ЭПР - эндоплазматический ретикулум
эмп - эпителиально-мезенхимальный переход
Abi - АЫ (Abelson murine leukemia) interactor
AFC - adenomatous polyposis coli
Arp - actin related protein
Cdc42 - cell division cycle
DIC - differential interference contrast microscopy
E- (кадхерин) - epithelial
EC - extracellular
EPLIN - epithelial protein lost in neoplasm
F- (актин) - filamentous
FH - formin homology
G- (актин) - globular
GAP - GTPase activating protein
GDI - GDP-dissociation inhibitor
GEF - GDP/GTP exchange factor
GSK - glycogen synthase kinase
HAV - His-Ala-Val
HGF - hepatocyte growth factor
LIMK - FIM (Lin-11, Isl-1, Mec-3)-kinase
mDia - mammalian diaphanous-related formin
MMP - matrix metalloproteinase
N- (кадхерин) - neuronal
NCK - non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein
NF-кВ - nuclear factor-kappa В
NM - non-muscle myosin
NPF - nucleation-promoting factor
PAK - p21-activated kinase
зоне формирующегося контакта. Разрыв краевого пучка приводит к появлению двух быстро сокращающихся в латеральном направлении фрагментов. Симметрично расположенные фрагменты краевых пучков двух контактирующих клеток формируют своеобразные аркоподобные структуры, которые содержат миозин и смещаются в латеральном направлении вместе с расширением контакта. (Krendel and Bonder, 1999). Формирование аркоподобных структур сопровождается возникновением контактного паралича псевдоподиальной активности и подавление ретроградного тока актина в зоне контакта.
Предполагает ся, что новый вектор тангенциального натяжения, создаваемого аркоподобными структурами, вызывает контактный паралич и способствуют стабилизации АК и усилению аккумуляции Е-кадхерина в нём (Gloushankova et al., 1997).
В ходе созревания контакта, вдоль него формируется тонкий актиновый пучок, ассоциированный с |3-катенином, который не претерпевает центростремительного перемещения. Этот пучок является предшественником периферического пучка, ассоциированного со зрелыми контактами эпителиальных клеток.
АК фибробластов также тесно ассоциированы со структурами актинового цитоскелета. В исследовании Yonemura et al. (1995) было показано, что формируемые фибробластами АК представляют собой отдельные продолговатые кадхерин-содержащие кластеры, ассоциированные с концами актиновых пучков, отходящими от них вглубь клетки. Как было выявлено в последующих исследованиях формирование АК фибробластов определяется контрактильностыо ассоциированных с этими контактами прямых актиновых пучков (Gloushankova et al., 1998). С использованием ингибиторов Rho, ROCK и миозина было показано, что аккумуляция кадхерина-катенина в АК фибробластов зависит от активности Rho и ROCK (Miyake et al., 2006).