Роль актин-миозиновых структур в механизмах подвижности нормальных и трансформированных фибробластов

• Автор: Шутова, Мария Сергеевна
• Шифр специальности: 14.01.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 144 с. : ил.

Содержание.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Актуальность проблемы
Цели и задачи исследования
Научная новизна и практическая ценность работы
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Организация актинового цитоскелета нормальных фибробластов
1.1. Общая организация актина
1.2. Белки, индуцирующие полимеризацию актина
1.3. Миозины и их участие в построении актинового цитоскелета
1.4. Зональная организация цитоскелета: состав и молекулярная организация зон активного края
1.5. Динамика актинового цитоскелета фибробластов на примере распластывания
1.6. Ингибиторы полимеризации актина
1.7. Актнновый цнтоскелет и фокальные контакты
1.8. Rho-ГТФазы и регуляции перестроек цитоскелета
2. Микротрубочки и нх связь с актиновым цитоскелетом
2.1. Общая организация системы мнкротрубочек
2.2. Роль микротрубочек в разборке фокальных контактов
2.3. Функциональная связь мнкротрубочек с сократимостью
3. Трансформация клеток онкогеном ras
3.1. Белки Ras и нх роль в передаче сигнала
3.2. Фенотипические изменения клеток в результате неопластической трансформации
3.3. Нарушения структуры и функций фокальных контактов
3.4. Изменения подвижности клеток при трансформации
3.5. Возможные пути влияния Ras на цнтоскелет
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Клеточная культура
2. Ингибиторы
3. Иммунофлуоресцентное окрашивание и микроскопия
4. Оценка скорости распластывания и морфометрический анализ
5. DIC-видеомикроскопня
6. Анализ миграции в рану и направленности движения
7. Платиновые реплики и электронная микроскопия
7.1. Коррелятивная электронная микроскопия
7.2. Удаление актина с помощью гельзолнна
РЕЗУЛЬТАТЫ
Глава 1. Эффект ингибиторов сократимости на организацию и локомоторное поведение трансформированных фибробластов

1.1. Контрольные клетки
1.2. Локомоторный фенотип клеток с подавленной сократимостью
1.3. Способность клеток с подавленной сократимостью к поляризации
1.4. Потеря способности к поляризации и направленному движению при деполимеризации МТ колцсмидом
1.5. Динамика процесса распластывания клеток с подавленной сократимостью
Глава 2. Эффект ингибиторов сократимости на организацию и локомоторное поведение трансформированных фибробластов
2.1. Морфологические изменения фибробластов при ЯЛУ-трансформации
2.2. Морфология трансформированных клеток, обработанных ингибиторами сократимости
2.3. Миграция трансформированных клеток, обработанных ингибиторами сократимости
2.4. Эффект ингибиторов миозина 11 на динамику распластывания и поляризацию трансформированных фибробластов
Глава 3. Ультра структура цитоскелета клеток при разной степени подавления миозиновой сократимости
3.1. Ультраструктура контрольных фибробластов
3.2. Ультраструктура клеток, обработанных блеббнетатином (75 мкМ и 100 мкМ)
Глава 4. Восстановление актин-миозиновых структур при отмывке ингибиторов миозина II
Глава 5. Эффект ингибиторов полимеризации актина на локомоторное поведение нетраисформпрованных и трансформированных клеток
5.1. Морфология клеток, обработанных ингибиторами полимеризации актина
5.2. Миграция клеток, обработанных ингибиторами полимеризации актина
5.3. Эффект ингибиторов полимеризации актина на динамику распластывания
5.4. Восстановление клеток после ингибиторов миозина в присутствии латрункулнна А
ОБСУЖДЕНИЕ
1. Подавление сократимости в нетраисформпрованных клетках
1.1. Почему повышается подвижность?
1.2. Ускорение распластывания
1.3. Механизм поляризации клеток с пониженной сократимостью
1.4. Два локомоторных фенотипа (сократимый и несократимый)
2. Трансформация
2.1. Изменения в сократимости и организации актин-миозиновых пучков
2.2. Изменения поляризации, направленности движения и распластывания
2.3. Почему эффект ингибиторов сократимости на трансформированные клетки меньше?
2.4. Изменения в регуляции полимеризации актина
3. Для чего нужен миозин
3.1. Поляризация
3.2. Прикрепление и протрузия
3.3. Скорость движения
3.4. Построение актин-миозиновых пучков
4. Заключение
ВЫВОДЫ. 129 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений.
MT — MHKpoTpyöoHKH
Arp - Actin related protein
BSA - Bovine serum albumin
DIC - Differential Interference Contrast
DMSO - Dimethyl sulfoxide
ECM - Extracellular matrix
ERK - Extracellular signal-regilated kinase
FAK - Focal Adhesion Kinase
GAP - GTPase Activating Protein
GEF - GTF Excange Factor
HGF - Flepatocyte growth factor
IC50 — half maximal inhibitory concentration
LIMK - LIM-motif containing protein kinase
MAP — Mitogen Activated Protein
MFIC - Myosin Heavy Chain
MLC - Myosin Light Chain
MLCK - Myosin Light Chain Kinase
MTOC - Microtubule Organizing Center
PBS — Phosphate buffered saline
PDGF - Platelet-derived growth factor
PEG - polietilenglikol
PI3K-Phosphoinositide 3-kinase
PIP3 - Phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate
ROS - Reactive Oxygen Species
TGF - Transforming growth factor
TIRF - Total Internal Reflection Fluorescence
VASP - Vasodilator-stimulated phosphoprotein
WASP - Wiskott-Aldrich syndrome protein

Материалы и методы.
1. Клеточная культура.
В работе использовали клетки линии REF52tetRas, любезно предоставленные проф. Б.П. Копниным (Agapova et al., 1999; Kopnin et al., 2003). Клетки бьши получены из исходной линии REF52 (иммортализованные крысиные эмбриональные фибробласты) путем трансфекции плазмидой с человеческим геном конститутивно активного белка N-Rasaspl2 под тетрациклин-зависимым супрессором. Таким образом, мы имели возможность регулировать экспрессию онкогена N-Л/1 .S' и тем самым вызывать трансформацию клеток путем добавления/отмывки тетрациклина из среды. Клетки культивировали в среде DMEM (Sigma) с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки (PAA Laboratories GmbH, Austria) и антибиотиков (пенициллин, стрептомицин, 100 ед./мл) при температуре 37°С во влажной атмосфере в присутствии 5% ССД. Линию REF52tetRas вели в среде с добавлением тетрациклина в концентрации 2 мкг/мл каждые три дня. Для трансформации клеток тетрациклин отмывали и культивировали клетки в среде без тетрациклина в течение 5 дней, после чего использовали в экспериментах.
В нашей работе мы будем использовать термин “нормальные” (контрольные) фибробласты как синоним термина “нетрансформированные”. Несмотря на то, что контрольные клетки представляют собой постоянную иммортализованную линию, они фенотипически очень сходны с первичными культурами фибробластов. В пользу их “нормальности” говорит также тот факт, что трансдукция N-/<71.5 приводит к остановке пролиферации на 7-ой день экспрессии онкогена, вызванной повышением функциональной активности белка р53 (Kopnin et al., 2003). В течение месяца происходит возврат к нормальному фенотипу.
Часть экспериментов проводили также и на других линиях фибробластов - 10(3) и 10(3)Ras. Для этой пары были получены очень сходные данные, что и для REF52tetRas, однако они не были включены в настоящую работу.
2. Ингибиторы.
В экспериментах использовали следующие ингибиторы: Y27632 - ингибитор Rho-киназы, 45 мкМ (Calbiochem); блеббистатин - ингибитор АТФ-азной активности немышечного миозина II, 45, 75 и 100 мкМ (Toronto Research Chemicals Inc.) (10 мМ раствор в DMSO); ингибиторы полимеризации актина - латрункулин А, 0.5, 1,2 мкМ