Экспрессия изоформ сурвивина при немелкоклеточном раке легкого и ее влияние на свойства неопластических клеток

• Автор: Ковалева, Ольга Владимировна
• Шифр специальности: 14.01.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 117 с. : ил.

Оглавление
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Сурвивин и его роль в канцерогенезе
2.1.1 Белки семейства IAP
2.1.2 Строение сурвивина и его изоформы.
2.1.3 Локализация сурвивина в клетке
2.1.4 Регуляция экспрессии сурвивина
2.1.5 Функции сурвивина
2.1.5.1 Участие в митозе
2.1.5.2 Участие в апоптозе
2.2 Основные представления о метастазировашш
2.2.1 Участие сурвивина в процессах метастазирования
2.3 Исследование экспрессии сурвивина в клинической практике
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 Клеточные линии
3.2 Выделение нуклеиновых кислот
3.2.1 Выделение плазмидной ДНК
3.2.2 Выделение РНК из образцов тканей легкого
3.2.3 Выделение фрагментов ДНК для клонирования из агарозных гелей
3.3 Аналитический электрофорез ДНК в агарозных гелях
3.4 Молекулярное клонирование
3.4.1 Получение компетентных клеток Е. coli
3.4.2 Трансформация компетентных клеток Е.соИ
3.4.3 Обработка ДНК рестрицирующими эндонуклеазами
3.4.4 Реакция лигирования
3.5 Обратная транскрипция РНК
3.6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
3.7 Трансфекция
3.8 Инфицирование клеток
3.9 Анализ белков
3.9.1 Приготовление клеточных лизатов
3.9.2 Приготовление лизатов из образцов тканей легкого
3.9.3 Вестерн-блот гибридизация
3.9.4 Приготовление образцов для определения ферментативной активности протеиназ

3.9.5 Анализ желатиназной активности
3.9.6Анализ активности иРЛ
3.10 Исследование клеточных характеристик в культурах in vitro
3.10.1 Анализ динамики роста клеток
3.10.2 Анализ клеточной подвижности методом «зарастания раны» in vitro (wound healing assay)
3.10.3 Тест на образование колоний в условиях разреженной популяции
3.10.4 Тест на образование колоний в полужидкой среде
3.10.5 Тест на движение по градиенту концентраций факторов роста
3.10.6 Тест на инвазию in vitro
3.11 Определение экспериментальной метастатической активности
3.12 Статистическая обработка результатов
3.13 Растворы, реагенты и среды
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1 Анализ экспрессии изоформ сурвивина в образцах НМРЛ
4.2 Исследование влияния сурвивина дикого типа на свойства клеток в культуре in vitro
4.2.1 Получение ретровирусных векторов и клеточных линий, экспрессирующих сурвивин
4.2.2 Исследование характеристик, ассоциированных с опухолевой прогрессией, в полученных клеточных линиях в культуре in vitro.
4.2.2.1 Исследование динамики роста полученных культур
4.2.2.2 Анализ влияния сурвивина на клоногенность исследуемых клеточных линийбб
4.2.2.3 Анализ способности к неприкрепленному росту
4.2.2.4 Исследование миграционной способности полученных клеточных линий (“wound healing assay”)
4.2.2.5 Анализ движения по градиенту концентрации ростовых факторов
4.2.2.6 Анализ инвазивных свойств полученных клеточных линий
4.2.2.7 Исследование экспериментальной метастатической активности (ЭМА) полученных клеточных линий
4.3 Исследование влияния сурвивина дикого типа на экспрессию белков, вовлеченных в процесс опухолевой прогрессии
4.3.1 Анализ активности секретируемых протеииаз, ремоделиругощих ВКМ
4.3.1.1 Анализ уровня секреции матриксных металлопротеиназ (ММР)
4.3.1.2 Анализ уровня секреции урокиназа-подобного активатора плазминогена (иРА)

4.3.2 Анализ экспрессии белков фокальных контактов
4.3.3 Анализ экспрессии МАР-киназ
4.4 Исследование влияния сурвнвина-2а на клеточные характеристики и экспрессию белков, вовлеченных в процесс опухолевой прогрессии
5. ОБСУЖДЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Список

APAF-

ERK1/

hTERT

использованных сокращении
аденокарцинома внеклеточный матрикс немелкоклеточный рак легкого плоскоклеточный рак легкого рак легкого рак молочной железы
экспериментальная метастатическая активность apoptosis-inducing factor (фактор, вызывающий апоптоз) adaptor protein 1 (адапторный белок 1)
Apoptotic protease activating factor 1 (фактор, активирующий апоптозную протеазу)
В-cell lymphoma-2 protein (белок В-клеточной лимфомы)
Basic fibroblast growth factor (фактор роста фибробластов)
Breast cancer 1 (рак молочной железы)
Cell division control protein 42 homolog (гомолог белка контролирующего деление клеток 42)
Cyclin dependent kinase 1 (циклин-зависимая киназа 1) diacylglicerol (диацилглицерол)
epidermal growth factor (эпидермальный фактор роста) epidermal growth factor receptor (рецептор эпидермального фактора роста
extracellular signal-regulated kinase 1/2 (киназа регулируемая внеклеточными факторами 1/2)
Focal Adhesion Kinase (киназа фокальной адгезии)
Hepatocyte growth factor (фактор роста гепатоцитов)
Heat shock proteins (белки теплового шока)
human Telomerase reverse transcriptase (обратная транскриптаза теломер)
Inhibitor Apoptosis Protein (белки ингибиторы апоптоза)
Недавние исследования показали, что повышенная экспрессия сурвивина-2В коррелирует с лучшим прогнозом при раке прямой кишки, и его экспрессия на III и IV стадиях ниже, чем на I и II (Suga et al., 2005). В подтверждение этому экспрессия сурвивина-2В в клеточной линии рака легкого А549 вызывает снижение скорости пролиферации и апоптоз (Ling et al., 2005).
Для опухолевых клеток локализация сурвивина также может служить маркером прогноза и течения болезни (Li, 2005, Roland et al., 2007), в том числе и при HMPJI. Так, преимущественная ядерная локализация сурвивина при снижении цитоплазматического пула белка в опухолевых образцах ассоциировалась с более высокой выживаемостью пациентов с HMPJI (Vischioni et а/.,2004).
Очевидно, что роль сурвивина в биологии опухолевой клетки заключается не только в ингибировании апоптоза. Как в нормальных, так и в опухолевых клетках сурвивин принимает участие в митозе (Altieri., 2003). Также непосредственное участие сурвивина в канцерогенезе подтверждает его участие в ангиогенезе (Tran et al., 1999; Harfouche et al., 2002).
Endoh с соавторами обнаружили еще одну интересную функцию сурвивина в неопластических клетках. Они показали, что экспрессия сурвивина повышает активность теломеразы, регулируя экспрессию hTERT в клеточной линии рака толстой кишки. Так сурвивин увеличивает активность связывания Spl и с-Мус с промотором hTERT. Таким образом, авторы предполагают, что сурвивин, помимо уже известных функций, также участвует в продлении жизни трансформированных клеток (Endoh et al., 2005).
Из всего вышесказанного следует, что сурвивин представляется крайне привлекательной мишенью для разработки новых стратегий противоопухолевой терапии. Так, молекулярные антагонисты сурвивина, по крайней мере, некоторые, протестированные до сегодняшнего дня,