Трансгенные Т-клеточные рецепторы в противоопухолевом иммунном ответе

• Автор: Силаева, Юлия Юрьевна
• Шифр специальности: 14.01.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 161 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Цели и задачи исследования

Научная новизна исследования

Теоретическая и практическая значимость работы

Методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Методы статистической обработки данных

Апробация диссертации
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Развитие первичного иммунного ответа. Формирование иммунологической памяти
2. Идентификация CD8+ Т-клеток памяти
2.1. Функциональные особенности CD8+ Т-клеток памяти
2.2. Поверхностный фенотип Т-клеток памяти CD8+
2.3. Соответствие поверхностного фенотипа и функциональных характеристик CD8+ Т-клеток
3. Центральные и эффекторные Т-клетки памяти
4. TCR клеток памяти
5. Возможные механизмы формирования пупа Т-клеток памяти
6. Поверхностный фенотип предшественников CD8+ Т-клеток памяти
7. Транскрипционные факторы, регулирующие дифференцировку CD8+ Т-клеток во время иммунного ответа
8. Факторы, влияющие на формирование пула CD8+ Т-клеток памяти
9. Гомеостаз Т-клеток памяти
10. Т-клетки памяти в условиях лимфопении
11. Экспериментальные системы для изучения Т-клеток памяти в условиях лимфопении
12. Влияние экспрессии трансгенного TCR на тимусную селекцию
13. Противоопухолевый иммунный ответ. Иммунологический надзор и иммунная селекция опухолевых клеток
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Растворы и среды
2. Животные
3. Антитела
3. Клеточные линии
4. Создание трансгенных животных
5. Получение потомства и анализ наличия трансгена
6. Анализ наличия трансгена в геноме мышей методом ПЦР
7. Получение линий трансгенных мышей на генетической основе линии B10.D2(R101)
8. Получение гибридов FI (lDlbFM X C57BL/10)
9. Выделение мононукпеаров из периферической крови
10. Оценка количества лимфоцитов, экспрессирующих трансген, на периферии
11. Иммунизация мышей
12. Оценка уровня противоопухолевого иммунного ответа in vivo
13. Облучение мышей
14. Приготовление клеточных суспензий
15. Адоптивный перенос
15. Реакция MLR

16. Реакция бластгрансформации
17. Цитотоксический тест
18. Окрашивание антителами и анализ на проточном цитофлуориметре
19. Статистическая обработка данных
РЕЗУЛЬТАТЫ
ГЛАВА 1. Функциональная активность Т-клеток памяти в условиях лимфопении, вызванной сублетальным облучением
1.1. Аллогенный иммунный ответ клеток памяти и экспрессия поверхностных маркеров CD44 и CD62L спленоцитами сублетально облученных мышей
1.2. Аллогенный иммунный ответ клеток памяти и экспрессия поверхностных маркеров CD44 и CD62L клетками селезенки сублетально облученных мышей после адоптивного переноса сингенных спленоцитов
1.3. Иммунный ответ сублетально облученных мышей после адоптивного переноса сингенных спленоцитов на клетки алпогенной опухоли in vivo
ГЛАВА 2. Создание первичных трансгенов по p-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти 1D1 и получение трансгенных линий lDlbFMH IDlbFF на генетической основе линии B10.D2(R101)
2.1. Получение первичных трансгенов
2.2. Получение линий трансгенных мышей на генетической основе линии B10.D2(R101)
ГЛАВА 3. Развитие и поддержание гомеостаза CD3+лимфоцитов мышей трансгенных
линий lDlbFM и lDlbFF
3.1 Поверхностный фенотип тимоцитов мышей трансгенных линий lDlbFM и lDlbFF.
3.1.1. Поверхностный фенотип тимоцитов мышей трансгенной линии lDlbFM
3.1.2.Поверхностный фенотип тимоцитов мышей трансгенной линии lDlbFF
3.2. Поверхностный фенотип периферических CD3+ Т-лимфоцитов мышей трансгенных линий lDlbFMn lDlbFF
3.2.1. Поверхностный фенотип периферических CD3+ Т-клеток мышей линии
lDlbFM
3.2.2 Поверхностный фенотип периферических CD3+ Т-клеток мышей линии lDlbFF
3.3. Поверхностный фенотип тимоцитов и периферических Т-клеток мышей гибридов F1 (lDlbFM X C57BL/10)
3.3.1. Поверхностный фенотип тимоцитов гибридов FI (lDlbFM X C57BL/10)
3.3.2. Поверхностный фенотип периферических Т-лимфоцитов гибридов F1 (lDlbFM X C57BL/10)
ГЛАВА 4. Т-лимфоциты мышей трансгенной линии lDlbFF в условиях лимфопении
ГЛАВА 5. Первичный аллогенный ответ Т-лимфоцитов мышей трансгенной линии lDlbFM
in vitro
ГЛАВА 6. Иммунный ответ Т-лимфоцитов мышей линии lDlbFM на клетки аллогенной опухоли in vivo
6.1. Первичный аллогенный ответ спленоцитов мышей линии lDlbFM на клетки тимомы EL-4 in vivo
6.2. Продолжительность жизни трансгенных мышей линии lDlbFM, иммунизированных аллогенной опухолью
6.3. Селекция опухолевых клеток в организме трансгенных животных
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Функциональные особенности Т-клеток памяти в условиях лимфопении
Создание TCR-трансгенной модели
Развитие трансгенных Т-клеток в тимусе

Поверхностный фенотип периферических Т-лимфоцитов трансгенных линий lDlbFM и
lDlbFF у интактных животных и в условиях лимфопении
Аллогснный иммунный ответ спленоцитов мышей трансгенной линии lDlbFM in vitro.. .134 Иммунный ответ Т-лимфоцитов мышей линии lDlbFM на клетки тимомы EL-4 in vivo
Иммунная селекция опухолевых клеток в организме трансгенных животных
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

время инфекции локализуются в разных компартментах селезенки и обладают различными профилями экспрессии цитокинов [Cheung, Yang, Goldrath, 2009].
11. Экспериментальные системы для изучения Т-клеток памяти в условиях лимфопснии
Противоречия в данных о функциональной активности популяции Т-клеток с поверхностным фенотипом клеток памяти, появляющейся в условиях лимфопении, могут быть следствием использования исследователями разных экспериментальных систем.
Разными исследователями используются различные модельные системы для создания условий лимфопении. Лимфопения может быть вызвана конститутивным отсутствием Т-клеток в организме. Для этого чаще всего используются животные, дефектные по генам рекомибиназ Ragl и Rag2, или СОЗе-нокауты [Cho и др., 2000] [Tanchot и др., 2002]. В других исследованиях лимфопения создается с помощью сублетального облучения животных [Ge и др., 2002] [Hamilton и др., 2006] [Hamilton, Jameson, 2008]. Наиболее принципиальное различие между этими двумя системами заключается в отсутствии тимопоэза в организме мышей с конститутивно отсутствующими Т-клетками, что приводит к невозможности восстановления периферического пула Т-лимфоцитов за счет выхода из тимуса собственных Т-клеток реципиента. Показано, что в организме сублетально облученных реципиентов адоптивно перенесенные Т-клетки с поверхностным фенотипом клеток памяти достаточно быстро замещаются вышедшими из тимуса Т-лимфоцитами реципиента [Tanchot и др., 2002].
Для адоптивного переноса обычно используют Т-клетки с трансгенным Т-клеточным рецептором, лиганд для которого известен. Наиболее часто используют ОТ-1 CD8+ Т-клетки, специфичные к пептиду 257-264 овальбумина [Hamilton, Jameson, 2008] [Goldrath, Bevan, 1999] [Cheung, Yang, Goldrath, 2009]. Также для адоптивного переноса используют 2С трансгенные CD8+ Т-клетки [Ge