Влияние омега-3 полиненасыщенных жирных кислот и ацетилсалициловой кислоты на показатели воспаления и атерогенез (экспериментально-клиническое исследование)

• Автор: Сорокин, Александр Владимирович
• Шифр специальности: 14.01.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Курск
• Количество страниц: 95 с. : 38 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Омега-3 жирные кислоты в системе сердечно-лёгочной патологии

1.2. Механизмы действия омега-3 жирных кислот

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Экспериментальные диеты и их влияние на вес тела

3.2. Влияние экспериментальных диет на липиды плазмы и липопротеины

3.3. Эффекты экспериментальных диет на развитие атеросклероза

3.4. Воздействие экспериментальных диет на васкулогенез
3.5. Эффекты экспериментальных диет на воспаление
3.6. Эффекты экспериментальных диет на тканевую экспрессию генов
3.7. Изменение уровней циркулирующего РСБК9 на фоне экспериментального лечения
3.8. Влияние экспериментальных диет на липидные медиаторы
Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
4.1. Клиническая оценка эффектов омега-3 ПНЖК в комбинации аспирина и статина
4.2. Особенности проведения ЧКВ у больных ИБС в сочетании с ХОБЛ
Глава 5. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы:
Атеросклероз является ключевым патофизиологическим процессом, приводящим к развитию сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), которые остаются лидирующими причинами смерти, инвалидности и основными статьями расхода здравоохранения РФ [1] и США [191]. Доказанным фактом является то, что повышенный уровень триглицеридов (ТГ) и провоспалительных цитокинов имеет прочную взаимосвязь с развитием ССЗ [138]. Основываясь на множестве, как животных, так и клинических моделей длинноцепочечные п-3 полиненасыщенные жирные кислоты (п-3 ПНЖК/РиРА или ю-3 жирные кислоты), содержащиеся в рыбе, такие как эйкозапентаеновая (ЭПК) и докозагексаеновая кислоты (ДГК), также известные как омега-3 жирные кислоты, считаются атеропротективными молекулами за счёт мощного триглицеридснижающего и противовоспалительного эффектов [158, 125]. Ацетилсалициловая кислота (АСК), лучше известная как аспирин, является мощным ингибитором циклооксигеназы (ЦОГ)-1, 2 и положительно влияет на предотвращение сердечно-сосудистых событий. Данный эффект главным образом приписывается её антитромбоцитарным свойствам [16], но возможно объясняется и общими противовоспалительными качествами АСК [187]. Недавние клинические трайалы показали благоприятное воздействие комбинированной терапии омега-3 ЖК и АСК в снижении уровня воспалительных цитокинов и возможность синергичного эффекта по уменьшению риска ССЗ [177].
Хотя имеется общепризнанное экспертное согласие о положительном воздействии омега-3 ЖК вместе с АСК на липиды и противовоспалительные агенты, детальное объяснение механизмов, лежащих в основе комбинации описываемых 2 веществ, до сих пор остаётся не известным и имеет противоречивые результаты [79, 39]. Ряд учёных полагает, что терапевтическое воздействие омега-3 ЖК на ССЗ отличается от снижения ТГ плазмы и возможно связано с их участием в воспалительном ответе за счёт липидных медиаторов [41]. Одним из предполагаемых

механизмов, описывающих синергизм лечения АСК с омега-3 ЖК, является способность изменять генерирование специализированных проразрешающих медиаторов (БРМ), таких как резолвины, протектины и их аспиринтриггерные формы [156], образующиеся из омега-3 ПНЖК. 8РМ являются ключевыми молекулами в стадии разрешения воспалительного процесса и возможно также обладают анти-атеросклеротическими качествами [110]. Ацетилирование ЦОГ-2 АСК приводит к ингибированию формирования простагландинов, однако продукция 15К-НЕТЕ из арахидоновой кислоты (АА) не прекращается [38]. Дальнейшая конверсия ВЯНЕТЕ в лейкоцитах может привести к образованию аспиринтриггерных липокси-нов (АТЬ), обладающих мощными противовоспалительными эффектами [38]. Таким образом, эндогенный биосинтез и метаболизм БРМ из омега-3 ЖК может меняться в присутствии АСК, что в дальнейшем способно значимо повлиять на ате-рогенез модифицируя воспалительный ответ.
Цель исследования: изучить атеропротективные и противовоспалительные эффекты терапевтического приёма омега-3 ПНЖК как самостоятельно, так и в комбинации с ацетилсалициловой кислотой в экспериментально-клиническом исследовании.
Задачи исследования:
1. Определить влияние омега-3 ПНЖК, а именно ЭПК и ДГК, а также ацетилсалициловой кислоты, на систему воспаления в период 13 недель лечения ароЕ-КО мышей специально сформулированными экспериментальными диетами путём диагностики уровней циркулирующих цитокинов плазмы, активности ЦОГ-1,2, тканевой экспрессии генов в печени; а также анализа метабололипидома лёгких, селезёнки и аорты с помощью жидкостной хроматографии-тандем масс спектрометрии.
2. Провести анализ степени атеросклеротического поражения исследуемых групп ароЕ-КО мышей по данным изменения липидного спектра плазмы, морфометрического и иммуногистохимического анализа аорты и её ветвей, клеточных эссе неоваскулогенеза и миграционной активности, а также методами поточной цитофлюорометрии и тканевой экспрессии генов в аорте.

CD146/ CD45/ CD133/ CD309. Антитела были приобретены от BioLegend (San Diego, СА, USA) и сам анализ проводился на BD LSR II поточном цитометре (BD Biosciences, San Jose, California, USA) с FCSExpress (Research Edition), версия 4.0 (De Novo Software, Los Angeles, CA, USA).
Клетки инкубировались с блокирующим буфером (1% бычьим сывороточным альбумином (BSA) и 1% FBS) в течение 20 минут па льду. Далее клетки инкубировались с флюорохром-меченными противомышиными антителами крысы в течение 30 минут на льду. Клетки отмывались PBS и снова центрифугировались при 300 х g для седиментации и немедленного анализа. Диапазон обнаружения (“ворота”) клеток включал только мононуклеарные клеточные события с исключением дупликата клеток, тромбоцитов и мёртвых клеток/остатков. Для ЕРС вторичные ворота включали только те клетки, которые негативны на CD45 (РегСР/Су 5.5) и Lin-маркёры. Третьи ворота включали клетки, имеющие двойную позитивную к CD34 (РЕ) и CD309 (АРС) экспрессию и лишь клетки, имевшие высокоинтенсивную двойную флюоресценцию, считались ЕРС. Парные флюорохромные изотипы контроля (PerCP/Cy 5.5-IgG2b, РЕ- IgG2a, APC/Cy7-IgG2b, APC-IgG2a; BioLegend, San Diego, CA, USA) как и не окрашенные образцы использовались для создания правильных параметров ворот и служили негативным контролем.
Для СЕС вторичные ворота использовались с целью отбора только клеток, имевших негативную CD45 (РегСР/Су 5.5) и позитивную CD146 (FITC) экспрессию, только имевшие высокоинтенсивную двойную флюоресценцию (CD146+++/CD45—) клетки считались СЕС. Парные флюорохромные изотипы контроля (FITC-IgG2a, Biotin-lgG2a, PerCP/Cy 5.5-IgG2b, APC-IgG2a; BioLegend, San Diego, CA, USA), как и не окрашенные образцы использовались для создания правильных параметров ворот и служили негативным контролем.
Выделение клеток и культивирование
Эндотелиальные клетки из пупочной вены человека (Human Umbilical Vein Endothelial Cells/HUVECs) были получены из Американского клеточного депозитария (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) и культивированы в среде ЕВМ-2 (Lonza, Walkersville, MD, USA) с добавлением 10% бычьей феталь-