Разработка и совершенствование методов определения ГМО в сырье, продуктах и кормах на основе ДНК- и иммунодиагностики

• Автор: Панюшкин, Александр Игоревич
• Шифр специальности: 06.02.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 198 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ обзор

1.1 Генномодифицированная продукция и ее значение

1.2 Вопросы безопасности ГМО, необходимость контроля и маркировки

1.3 Методы определения ГМО

1.3.1 Методы определения ГМО на основе анализа нуклеиновых кислот

1.3.2 Методы определения ГМО на основе анализа белков

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Цель и задачи исследования

2.2 Материалы и методы
2.2.1 Отбор и подготовка проб для исследования
2.2.2 Методика выделение ДНК с использованием детергента СТАВ.
2.2.3 Методика выделения ДНК с использованием сорбента Silica
2.2.4 Методика качественного определения ГМИ на основе ПЦР с электрофоретической детекцией ампликонов
2.2.5 Методика качественного определения ГМИ с помощью ПЦР в реальном времени
2.2.6 Методика количественного определения ГМИ с помощью ПЦР в реальном времени
2.2.7 Методика идентификации ГМО с применением биологического микрочипа (ГОСТ Р 52174-2003)
2.2.8 Методика определения ГМО на основе амплификации с

последующей ДНК-гибридизацией с использованием тест-систем ЗіпеРоосІ
2.2 9 Модифицированная методика определения ГМО с применением ДНК-зо'ндов иммобилизованных на мембранных биочипах
2.2 10 Методика иммунохроматографического определения трансгенных белков
2.2.11 Статистическая обработка результатов
2.3 Результаты исследований
2.3.1. Разработка методов определения трансгенных белков в растительном сырье и растительных кормах на основе иммунохроматографии
2.3.2. Валидация иммунохроматографического метода для определения ГМО в продуктах и кормах, содержащих ингредиенты животного и растительного происхождения
2.3.3. Совершенствование определения ГМО на основе ПЦР с последующей ДНК-гибридизацией
2.3.4. Разработка модифицированного метода определения ГМО с использованием ДНК-чипов
2.3.5. Количественное определение ГМО на основе ПЦР в режиме «реального времени»
2.3.6. Проведение мониторинговых исследований по выявлению ГМО в продуктах и кормах с использованием различных методов ДНК- и иммунодиагностики
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4. ВЫВОДЫ
5. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
7. ПРИЛОЖЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы
С помощью генной инженерии получены различные трансгенные растения (соя, кукуруза, картофель, хлопчатник, сахарная свекла) с устойчивостью к вирусам, колорадскому жуку и другим насекомым, а также к пестицидам. Производство и оборот трансгенной продукции увеличивается в мире год от года (9, 24, 32). В настоящее время определенная часть находящихся в обороте в России продуктов и кормов содержат компоненты из генномодифицированных источников (ГМИ). Так как замена трансгенными компонентами белков животных и растений - весьма выгодный бизнес, трансгенные белки постоянно возрастающими темпами заменяют в продуктах питания и кормах биологически полноценные животные белки и растительные белки традиционных культур.
Мнения ученых о безопасности генетически модифицированных организмов (ГМО) расходятся. Одни исследователи считают, что генномодифицированный организм безвреден, по мнению других, он является источником биологических и экологических рисков для человека, животных и окружающей среды (56). Эти риски могут быть связаны как с плейотропным эффектом трансгенного белка, так и со свойствами самой встроенной-конструкции, в том числе с регуляторным действием на соседние гены. Введение в пищевую цепочку человека или животных трансгенных структур может привести к непредсказуемому воздействию на их здоровье. В ГМО вместе с целевыми генами могут интегрироваться и другие фрагменты ДНК, несущие гены с нежелательными признаками, например, гены, кодирующие токсины или устойчивость к антибиотикам.
В различных странах, включая Россию, создание, производство, реализация продукции, содержащей трансгенные компоненты, подлежит государственному регулированию. Содержание трансгенных конструкций в продуктах и кормах в соответствии с указаниями Роспотребнадзора и Россельхознадзора должно быть продекларировано. В соответствии с

прогревали при +56°С в течение нескольких минут. Смесь центрифугировали при 16000 об/мин (10000-12000 g) в течение 10 сек.
11. Осторожно удаляли надосадочную жидкость. К осадку добавляли 700 мкл этанола. Перемешивали на Vortex при средних оборотах. Центрифугировали при 16000 об/мин (10000-12000 g) в течение 10 сек.
12. Осторожно удаляли надосадочную жидкость. К осадку добавляли 700 мкл ацетона. Перемешивали на Vortex при средних оборотах. Центрифугировали при 16000 об/мин (10000-12000 g) в течение 10 сек.
13. Надосадочную жидкость тщательно удаляли. Пробирки оставляли с открытыми крышками до полного испарения жидкости. Иногда слегка подсушивали осадок в термостате, при этом избегали спекания осадка.
14. Сухой осадок растворяли в 50 мкл ТЕ-буфера. Раствор ДНК рекомендуется хранить при -20°С. Выделенную и очищенную ДНК использовали для постановки ПЦР.
2.2.4 Методика качественного определения ГМИ на основе ПЦР с электрофоретической детекцией ампликонов.
ПЦР проводили по собственной разработанной программе, в автоматическом режиме на амплификаторах производства МГТУ им. Баумана (Россия).
В качестве матрицы для качественного определения ГМИ’ использовали выделенную и очищенную ДНК из термообработанных и нативных продуктов.
Перед выполнением ПЦР рассчитывалось количество реакций. Расчет производили по следующей формуле:
Количество реакций = 2 х количество проб + 4 контроля ПЦР
Маркировали необходимое количество пробирок для исследуемых образцов, также 2 пробирки для положительного контрольного образца (контроль эффективности ПЦР) и 2 пробирки для отрицательного контрольного образца (контроль контаминации).
Пример для 10 проб: