Определение ивермектинов в продуктах животного происхождения методом иммуноферментного анализа

• Автор: Тарасов, Илья Евгеньевич
• Шифр специальности: 06.02.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 140 с.

НАЗВАНИЕ РАЗДЕЛОВ

ОГЛАВЛЕНИЕ . .Л*.'

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ б

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СОЕДИНЕНИЙ АВЕРМЕКТИНОВОЙ ГРУППЫ, ХИМИЧЕСКОЕ СТРОЕНИЕ АВЕРМЕКТИНОВ

1.1. Характеристика ивермектина

1.2. Механизм биологического действия ивермектина

1.3. Терапевтическая эффективностышермектина 16.

1.4. Распределение ивермектина в органах и тканях животных и выделение его с молоком

1.5. Методы анализа ивермектинов в продуктах животного происхождения

1.5.1. Физико-химические методы
1.5.2. Биологические методы
1.5.3. Химико-биол огические методы 3
1.5.4. Методы подготовки проб для анализа ивермектина
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Получение конъюгата ивермектина с бычьим сывороточным альбумином
2.2. Получение моноклональных антител
2.2.1. Иммунизация
2.2.2. Миеломная клеточная линия
2.2.3. Культивирование клеток
2.2.4. Слияние клеток и выращивание гибридом
2.2.5. Криоконсервация гибридом
2.2.6. Получение асцитных жидкостей,-содержащих МКА
2.2.7. Получение МКА из асцитных жидкостей
2.3. Иммунохимические свойства моноклональных антител
2.3.1. Субтипирование МКА '
2.3.2. Методы твердофазного иммуноферментного анализа
2.4. Получение конъюгата моноклональных антител с пероксидазой хрена
2.5. Метрологические параметры метода ИФА
2.5.1. Чувствительность метода
2.5.2. Специфичность метода
2.5.3. Воспроизводимость метода '
2.6. Постановка конкурентного ИФА
2.7. Приготовление калибровочных проб
2.8. Отбор проб биоматериала
2.9. Экспериментальная контаминация образцов
2.10. Экстрагирование ивермектина из проб молока, мышц, печени и ^ жира
2.11. Определение ивермектина в биоматериале методом ВЭЖХ с использованием флюоресцентного детектора
2.11.1. Реактивы и оборудование
2.11.2. Подготовка реагентов и растворов
2.11.3. Условия хроматографирования
2.11.4. Отбор и подготовка проб для анализа
2.11.5. Метрологические характеристики метода
2.12. Препараты, использованные для обработки животных
2.13. Изучение выделения ивермектина с молоком и его определение в органах и тканях сельскохозяйственных животных
2.14. Обработка полученных результатов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Разработка иммуноферментного метода определения ивермектина
в продуктах животного происхождения
3.1.1. Получение конъюгата ивермектина с бычьим сывороточным

альбумином
3.1.2. Получение МКА к ивермектину ,
3.2. Использование МКА 4с6 в конкурентном ИФА
3.2.1. Чувствительность метода
3.2.2. Специфичность метода
3.2.3. Воспроизводимость метода
3.3. Оценка эффективности экстракции ивермектина из проб мяса,
жира, печени и молока
3.4. Изучение динамики выведения препаратов на основе ивермектина
из организма животных с молоком
3.5. Изучение распределения ивермектина в органах и тканях животных
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
5. ВЫВОДЫ
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
8. ПРИЛОЖЕНИЕ

, Сотрудниками ВНИИВСГЭ .была проведена работа по определению-остаточных количеств ивермектинов, в составе препаратов гиподектина накожного и гиподектина инъекционного. Определение остаточных количеств велось с помощью тонкослойной хроматографии в сочетании с УФ-денситометрией. Этот метод основан на извлечении 22,23-дигидроавермектина Bj из молока, органов и тканей органическими растворителями, очистке перераспределением в системах несмешивающихся растворителей,
концентрирования, хроматографии в тонком слое силикагеля и
количественного определения с помощью УФ в сочетании с денситометрией. Чувствительность метода составляла 4-5нг/мл/г.
В 2000 году В.Г. Тер-Симонян, С.В. Авчук провели работу по определению Аверсектина G в органах и тканях животных, плазме и молоке методом ВЭЖХ с флуоресцентным детектором. На ее основе были утверждены МУК 4.1.1012-01 Определение массовой концентрации аверсектина С в органах и тканях животных, плазме и молоке методом флуоресцентной
высокоэффективной жидкостной хроматографии. Чувствительность метода была 1нг/мл/г. Сущность метода заключалась в проведении экстрагирования-аверсектина С из биологического , материала с помощью изооктана и ацетонитрила, с применением прямой и обращеннофазной твердофазной экстракции. Полнота извлечения была от 80 до 92% [21].
В 2003 году исследователями Юдиной Т.В. и Калининым В .А. была
разработана методика определения остаточных количеств ивермектина в
печени, почках, мясе сельскохозяйственных животных и молоке методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методика основана на ВЭЖХ
с флуоресцентным детектором. Особенностью данного метода была очистка
дериватизированого производного после стадии дериватизации с помощью
патронов для твердофазной экстракции Florisil (Sep Рак). Чувствительность
> ' ; / данного метода составляет 1нг/мл/г, полнота извлечения ивермектина
составляла от 79,69% (из пробы жира) до 91,74% (из пробы молока).