Совершенствование методов определения стафилококковых инфекций у животных и в сырье животного происхождения на основе ДНК- и иммунодиагностики

• Автор: Розанов, Сергей Николаевич
• Шифр специальности: 06.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 128 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. Золотистый стафилококк и его характеристика
1.2. Стафилококковые и сопутствующие инфекции у животных,
в сырье и продуктах животного происхождения
1.3. Методы диагностики золотистого стафилококка и сопутствующих инфекций бактериальной и вирусной природы
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Цель и задачи исследования
2.2. Объекты и методы исследований
2.2.1. Микробиологические методы определения Staphylococcus aureus в биоматериале
2.2.2. Выделение и очистка ДНК из бактерий
2.2.3. Включение биотина в ДНК методом ник-трансляции
2.2.4. Получение меченых ДНК-зондов с помощью полимеразной цепной реакции
2.2.5. Методика идентификации бактерий точечной ДНК-гибридизацией на мембранных фильтрах с биотинилированными ДНК-зондами
2.2.6. Методика идентификации парвовируса с применением тест-системы «ПАРВОВИР»
2.2.7. Методика определения стафилококковых и сопутствующих инфекций на основе амплификации с последующей ДНК-гибрид изацией
2.2.8. Методика определения антигенов парвовируса собак с использованием тест-набора SNAP Parvo

2.2.9. Методика выявления антигенов парвовирусного энтерита собак иммуноферментным анализом
2.2.10. Статистическая обработка результатов
2.3. Результаты исследований
2.3.1. Результаты мониторинговых исследований по выявлению Staphylococcus aureus и сопутствующих инфекций в биоматериале животных, в мясном сырье и субпродуктах
2.3.2. Разработка и совершенствование методик определения Staphylococcus aureus и сопутствующих инфекций в мясном сырье, субпродуктах и биоматериале животных на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией
2.3.3. Усовершенствование определения парвовируса в биоматериале с использованием тест-системы IDEXX SNAP
2.3.4. Разработка методики ускоренной индикации Staphylococcus aureus в сырье животного происхождения на основе точечной гибридизации со специфичными ДНК-зондами
2.3.5. Сравнительный анализ микробиологических методов и методов ДНК-диагностики по выявлению Staphylococcus aureus в биоматериале животных, в сырье и субпродуктах животного
происхождения
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы.
Стафилококковые инфекции достаточно широко распространены у различных животных. Основными проявлениями стафилококковой инфекции являются: гнойные воспаления кожи и подкожной клетчатки,
стафилококковый сепсис, синдром токсического шока, пневмонии, ангины, энтероколиты, отравление стафилококковым энтеротоксином и поражение центральной нервной системы. Резервуаром инфекции коагулазопозитивных стафилококков являются грызуны, птицы, крупный и мелкий рогатый скот, собаки, кошки. При этом заболевание проявляется у всех возрастных групп, но в большей степени у молодняка. Высок риск взаимного заражения золотистым стафилококком животных и человека. Выделение возбудителя происходит с носовыми истечениями, фекальными массами, мочой, истечениями из половых органов (препуция и влагалища), гнойными выделениями из кожных поражений (язвы, свищи).
Инкубационный период продолжается несколько дней. Клинические проявления стафилококковых болезней многообразны. При смешанном заражении стафилококками и вирусами (например,' парвовирус) иногда наблюдаются сходные клинические признаки заболеваний. Возбудитель 1ТВС-2 очень устойчив в окружающей среде и при комнатной температуре может сохраняться в инфицированных объектах в течение 6 месяцев (Б.Ф. Шуляк, 2003; М. Уиллард, Г. Тведтен, 2004; Я.Рэмси, Б.Теннат, 2005г). Лечение заболеваний, вызванных бактериальными, вирусными или смешанными инфекциями требуют различного подхода, вследствие чего, существует необходимость дифференциации возбудителей заболеваний.
Сырье животного происхождения (молоко, мясо, субпродукты) подвержено как первичной, так и вторичной контаминации ( Логвинов Д.Д., 1992; Горяйнова Г.М., 2004; Eshraghi H., 1997; Pfleger R. et al., 2002). При ветеринарно-санитарной экспертизе актуальным является дифференциация

Повторялась процедура отмывки. Супернатант отбирался полностью.
Пробирки помещали в термостат 65 градусов С на 5-10 минут для подсушивания сорбента. При этом крышки пробирок были открыты.
В пробирки добавляли по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК, перемешивали на вортексе и помещали в термостат 65 градусов С на 5 минут, периодически встряхивая на вортексе.
Центрифугировались 1 минуту при (10-12)х103 об/мин на микроцентрифуге. Супернатант содержал очищенную ДНК. Пробы были готовы к постановке ПЦР.
Постановка ПЦР-амплификации участка ДНК.
Пробирку с воском для ПЦР прогревали в термостате при 95 градусах по С до полного расплавления воска.
Раскапывали на дно микропробирок для амплификации по 5 мкл ПЦР-смеси-1 («нижней»). Сверху добавляли по капле (примерно 10-15 мкл) расплавленного воска так, чтобы он полностью накрыл жидкость. Закрывали крышки, на верхней части которых делали пометки «РУ».
Если воск покрывал жидкость не ровно или образовывались пузыри, пробирки прогревали в амплификаторе 20 минут при 95 градусах по С, а затем охлаждали.
В штатив ставили ряд пробирок с ПЦР-смесью-1 и воском в соответствии с количеством испытуемых проб, включая контрольные 1 этапа анализа, продолжая ряд, добавив 2 пробирки для контролей 2-го этапа анализа.
На поверхность воска вносили по 10 мкл ПЦР-смеси-2 («верхней»), при этом ПЦР-смесь-2 не должна была проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесь-1. В противном случае пробирка считалась браком и выбрасывалась.
Сверху по каплям добавлялось масло для ПЦР (примерно, 25 мкл).