Использование полимеразной цепной реакции в целях мониторинга благополучия по микобактериальным инфекциям зоопарковых, цирковых и сельскохозяйственных животных

• Автор: Калмыков, Виктор Михайлович
• Шифр специальности: 06.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Щелково
• Количество страниц: 157 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Используемые сокращения

1 Введение

2 Обзор литературы

2.1 Микобактериозы животных

2.2 Взаимосвязь микобактериозов человека и животных

2.3 Методы прижизненной диагностики туберкулёза животных

2.3.1 Аллергический метод

2.3.2 Бактериологический метод

2.3.3 Полимеразная цепная реакция
2.4 Особености диагностики туберкулёза диких животных (слонов, 40 обезьян, верблюдов, птиц)
2.5 Диагностика паратуберкулёза крупного рогатого скота
3 Собственные исследования
3.1 Материалы и методы
4 Результаты исследования
4.1 Культуральные и молекулярно-генетические исследования всех 66 трёх аллергенов, используемых в широкой ветеринарной практике
при диагностике туберкулёза и паратуберкулёза животных (ППД-туберкулин для млекопитающих, ППД-туберкулин для птиц и KAM), на наличие микобактерий и ДНК микобактерий
4.2 Сравнительное изучение эффективности автоматического и 69 «ручного» выделения ДНК из различных видов биоматериала с целью оптимизации ПЦР-анализа для мониторинга микобактериальных инфекций животных

4.3 ПЦР-исследование различных видов биоматериалов и объектов 80 внешней среды из вольеров и клеток с разными видами диких животных в ГУК «Московский зоологический парк» и Московском цирке Никулина и определение возможности применения ПЦР для мониторинга благополучия животных по туберкулёзу
4.4 Определение диагностической ценности и возможности 91 применения ПЦР в комплексе исследований при паратуберкулёзе
крупного рогатого скота
5 Обсуждение полученных результатов
6 Выводы
7 Практические предложения
8 Список использованной литературы
9 Приложения
Приложение
Приложение
Приложение
Приложение

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
ВКО - внутренний контрольный образец ВОЗ - всемирная организация здавоохранения ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИФА - иммуноферментный анализ
КАМ - комплексный аллерген из атипичных микобактерий
К+ - положительный контроль амплификации
К- - отрицательный контроль амплификации
МАР - Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis
мкл - микролитр
м.т./мл - микробных тел в 1 мл
НТМБ - нетуберкулёзные микобактерии
ПКО - положительный контрольный образец
ППД - Purified Protein Derivate (очищенный дериват белка)
ПЦР - полимеразная цепная реакция РНК - рибонуклеиновая кислота РСК - реакция связывания комплемента
ЦНИИЭ - Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора
BCG - бацилла Кальметта—Герена (Bacillus Calmette—Guérin)—вакцинный штамм Mycobacterium bovis
ELISA — твёрдофазный иммуноферментный анализ (Enzyme-linked immunosorbent assay) М. - Mycobacterium
M.avium- возбудитель туберкулёза птичьего вида M.bovis - возбудитель туберкулёза бычьего вида M.paratuberculosis - возбудитель паратуберкулёза M.phlei - вид нетуберкулёзной микобактерии M.tuberculosis - возбудитель туберкулёза человеческого вида

включают этап сорбции ДНК на специальный носитель с последующей ее очисткой и элюцией (R. Boom et al., 1990). Эта методика широко используется в «ручном» выделении, зарекомендовав себя как «золотой стандарт» среди методов экстракции нуклеиновых кислот. Конечный продукт экстракции -очищенные нуклеиновые кислоты, испольуемые в дальнейшем для амплификации.
На этот этап ПЦР-анализа огромное влияние оказывает так называемый «человеческий» фактор: квалификация сотрудника, соблюдение им
требований и режима работы в ПЦР-лаборатории и многие другие факторы. Автоматизация этапа выделения ДНК позволяет уменьшить количество лабораторных ошибок и повысить эффективность выявления микобактерий из исследуемого материала. Установлено, что при автоматизации выделения ДНК повышается эффективность анализа и специфичность ПЦР (Е. Gobbers, Т. Oosterlaken, М. van Bussel, R. Melsert, A. Kroes, E. Claas, 2001; P. Hammer, C. Kiesner, H.G. Walte, K. Knappstein, P. Teufel, 2002; J. H. Knepp, M. A. Geahr, M. S. Forman, A. Valsamakis, 2003; J.R. Stabei, T.L. Bosworth, T.A. Kirkbride, R.L. Forde, R.H. Whitlock, 2004; D. Herthnek, S. Englund, P.T.J. Willemsen, G. Bolske, 2006; C.V. Jaravata, W.L. Smith, G.J. Rensen, J.M. Ruzante, J.S. Cullor, 2006).
На сегодняшний день многие зарубежные компании предлагают автоматические системы для выделения нуклеиновых кислот. Как показывают результаты проведённых в нашей стране и за рубежом исследований широкие возможности приборов для автоматического выделения нуклеиновых кислот позволяют значительно повысить аналитические характеристики имеющихся тестов (Е.В. Богословская, Г.М. Цыганова, В.В. Зайцев, Г.М. Башкирова, Г.А. Шипулин, 2007).
Радикальным решением проблемы контаминаций продуктами ПЦР стал переход от электрофоретической к гибридизационно-флуоресцентной детекции продуктов ПЦР в закрытой системе (M.J. Espy et al., 2006). Сущность метода заключается в исследовании накопления продуктов амплификации с помощью специального прибора без последующего электрофореза (W.K.