Диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции

• Автор: Войтова, Ксения Васильевна
• Шифр специальности: 06.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 122 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Характеристика респираторно-синцитиальной инфекции крупного

рогатого скота

1.1.1. Историческая справка

1.1.2. Характеристика возбудителя

1.1.3. Структура и функционирование генома вируса

1.1.4. Антигенные и генетические подгруппы вируса

1.2. Эпизоотологические данные

1.3. Особенности патогенеза, клинических признаков и патоморфологических изменений при респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота
1.3.1. Патогенез
1.3.2. Клинические признаки
1.3.3. Патоморфологические изменения
1.4. Диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного
рогатого скота
1.4.1. Выделение вируса в культурах клеток
1.4.2. Серологическая диагностика
1.4.3. Разработка и применение полимеразой цепной реакции для диагностики РСИ КРС
1.5. Заключение по обзору литературы
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы и методы
2.2. Результаты исследований
2.2.1. Распространение и характер проявления РСИ КРС в хозяйствах

региона Сибири
2.2.2. Особенности клинического проявления и патологоанатомических изменений при респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота в хозяйствах региона Сибири
2.2.3. Разработка ОТ-ПЦР для диагностики РСИ КРС
2.2.3.1 Подбор праймеров для постановки ПЦР
2.2.3.2 Компоненты ПЦР
2.2.3.3 Отработка оптимального режима амплификации и проверка чувствительности ПЦР
2.2.3.4 Определение специфичности ОТ-ПЦР
2.2.3.5 Влияние сроков хранения при различных температурных режимах на пригодность РНК вируса к исследованию в ОТ-ПЦР
2.2.4. Эффективность ОТ-ПЦР в производственных условиях
2 2 4 1 Частота выявления РНК вируса из проб биоматериала от животных
при вспышках респираторных болезней
2.2.4.2 Частота выявления РНК вируса у животных различных половозрастных групп
2.2.4.3 Частота выявления генома РСВ КРС и бактерий семейства
Раз1еиге11асеае в пробах биоматериала от больных и инфицированных животных
2.2.4.4 Экономическая эффективность ОТ-ПЦР
3. ОБСУЖДЕНИЕ
4. ВЫВОДЫ
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
7. ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ,
ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ДИССЕРТАЦИИ
РСИ КРС - респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота
РСВ КРС - респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота ПГ-3 КРС - парагрипп-3 крупного рогатого скота ИРТ КРС - инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота ВД-БС КРС - вирусная диарея-болезнь слизистых оболочек крупного рогатого скота
BHV-1 - герпесвирус крупного рогатого скота 1-го типа ВВ - выделение вируса
ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
ТЦЦ50/МЛ - тканевая цитопатическая доза 50/мл
ЦПД - цитопатическое действие
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
МЭБ - международное эпизоотическое бюро
РНК- рибонуклеиновая кислота

праймера с концентрацией 1мМ; 1,25 ед. активности термостабильной Тац ДНК-полимеразы; оставшийся объем занимает деионизованная вода. В смесь вносили кДНК в объеме 5 мкл. Поверх смеси наслаивали 2 капли минерального масла. Все манипуляции по приготовлению реакционной смеси осуществляли на тающем льду.
2.2.З.З. Отработка оптимального режима амплификации и проверка чувствительности ГПТР
С целью отработки оптимального режима амплификации проведения ПЦР отрабатывали три различных схемы проведения реакции.
Схема 1.: денатурация при 95°С — 30 сек., отжиг при 60°С - 15 сек., синтез при 72°С - 45 сек. Далее 35 циклов по схеме:-денатурация при 95°С -30 сек., отжиг при 60°С - 15 сек., синтез при 72°С — 45 сек. Синтез в последнем цикле при 72°С - 2 минуты. В результате проведенной реакции у нас все пробы дали отрицательный результат.
Схема 2.: денатурация при 95°С - 30 сек., отжиг при 60°С - 30 сек., синтез при 72°С - 45 сек. Далее 40 циклов по схеме: денатурация при 95°С -30 сек., отжиг при 60°С - 30 сек., синтез при 72°С - 45 сек. Синтез в последнем цикле при 72°С - 2 минуты. В результате получили одну положительную пробу.
Схема 3.: денатурация при 95°С — 30 сек., отжиг при 60°С - 30 сек., синтез при 72°С — 45 сек. Далее 35 циклов по схеме: денатурация при 95°С - 30 сек., отжиг при 60°С - 30 сек., синтез при 72°С - 45 сек. Синтез в последнем цикле при 72°С - 2 минуты. В результате проведенной реакции получили положительные пробы.
В качестве матрицы использовали штамм «РСБ №3» в разведениях 10'.1 - 10'7. Результаты исследований представлены в таблице 4.