Геномный полиморфизм Fusobacterium Necrophorum и оптимизация гнездовой ПЦР с целью усовершенствования диагностики некробактериоза животных

• Автор: Юрик, София Антоновна
• Шифр специальности: 06.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 126 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Характеристика возбудителя некробактериоза

1.1.1. Морфология Fusobacterium necrophorum

1.1.2. Культуральные и биохимические свойства

1.2. Диагностика некробактериоза

1.3. Полимеразная цепная реакция

1.3.1. Выделение ДНК

1.3.2. Подбор праймеров

1.3.3. Постановка полимеразной цепной реакции

1.4. Гнездовая ПЦР (nested PCR)
1.5. Исследование геномного полиморфизма bRAPD-ПЦР
1.6. Заключение по обзору литературы
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы и методы исследования
2.2. Результаты исследований
2.2.1. Изучение геномного полиморфизма F. necrophorum subsp. necrophorum с помощью RAPD-PCR-анализа
2.2.1.1. Усовершенствованние методики выделения ДНК из культур F. necrophorum и биообразцов с помощью цетриламмония
бромид (СТАВ)
2.2.1.2. Проверка чистоты выделенной ДНК
2.2.1.3. Выбор произвольных праймеров и проведение RAPD-PCR
2.2.2. Исследование патогенности культур Fusobacterium necrophorum на лабораторных животных
2.2.3. Генетическая характеристика культур Fusobacterium necrophorum
эиЬБр. песгорЬогиш
2.2.4. Оптимизация гнездовой ПЦР
2.2.5. Разработка совмещенной гнездовой ПЦР
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ
4. ВЫВОДЫ
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
6. ЛИТЕРАТУРА
7. ПРИЛОЖЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Некробактериоз - инфекционное заболевание домашних животных, проявляющееся гнойно-некротическим поражением различных тканей и органов. Болезнь встречается у многих видов диких животных, болеет им также человек. Возбудитель заболевания - Fusobacterium necrophorum (Е.А. Бобылева, 1940; О.И. Соломаха, 1973; А.А. Самоловов, 1986; L.H. Hagelskjaer et al., 1998).
Болезнь распространена во многих странах Европы, Северной Америки, Южной Африки, в Австралии (A.L. Lundstrom, 1981; А.М. Russell et al., 1982). В нашей стране некробактериоз регистрируется почти повсеместно, наблюдается у разных видов животных, но чаще среди северных оленей и рогатого скота (В.М. Львов, 1971; О.И. Соломаха, 1972). Болезнь причиняет экономический ущерб за счет снижения многих показателей, в т.ч. молочной продуктивности на 5-25%, интенсивности роста на 25-40% (Ю.Г. Анакина, 1988).
Для профилактики заболевания особое значение имеет достоверный и своевременный диагноз. Для его постановки применяют многочисленные методы: эпизоотологический, клинический, бактериологический, биологический, патологоанатомическое вскрытие. В настоящее время наиболее чувствительным и специфичным признан метод, основанный на выявлении фрагментов генома возбудителя в биологическом материале с помощью полимеразной цепной реакции. Необходимо отметить, что этот метод позволяет обнаружить концентрацию возбудителя в несколько раз меньшую, чем при традиционном бактериологическом исследовании. Это часто приобретает определяющее значение при постановке диагноза, так как в гнойно-некротическом очаге присутствует ассоциация микроорганизмов, а

О положительном результате анализа судили по размеру синтезированного фрагмента кДНК. Анализ считали положительным, если размер ампли-кона соответствовал ожидаемому размеру фрагмента в 546 н.п. В случае отсутствия расчетного фрагмента проводили реамплификацию со второй парой праймеров № 011 - № 022, а в качестве матрицы брали 1-2 мкл продуктов ПЦР с первой парой праймеров. Анализ считали положительным, если размер второго ампликона соответствовал ожидаемому размеру фрагмента в 187 н.п.
Для проверки специфичности гнездовой полимеразной цепной реакции использовали следующие штаммы: Escherichia coli АТСС 25922, Streptococcus pyogenes (гр. A), Staphylococcus aureus АТСС 25923, Proteus vulgaris (полевой гитами), Bacillus subtilis ТНП-3, Salmonella dublin 373 315/52, предоставленные сотрудниками лаборатории по изучению болезней молодняка д. вет. наук, профессором Н.А. Шкиль и с.н.с., к. вет. наук М.Н. Шадриной.
Для анализа нуклеотидных последовательностей F. necrophorum использовали данные EMBL/GenBank. Определение последовательностей олигонуклеотидных праймеров проводили по алгоритму выравнивания последовательностей в программах Alignment Service V.4.0 и GENCNER ( S.М. Resenchuk, V.M. Blinov, 1995), а для анализа праймеров по уровню свободной энергии использовали программу OLIGO 4.0. Химический синтез праймеров был осуществлен амидофосфитным методом на автоматическом синтезаторе ASM-102U (Biosset Ltd, Новосибирск) Ю.А. Горбуновым в отделе химии природных соединений ГНЦ ВБ "Вектор".
Для проведения RAPD-анализа использовали «произвольные» праймеры со случайной нуклеотидной последовательностью длиной в 10 н.п., которые выбирали, взяв за основу нуклеотидную последовательность лейкотоксина F. necrophorum штамма А25 в 12699 н.п.