Идентификация сортов косточковых культур с помощью ПЦР - анализа

• Автор: Романова, Ольга Витальевна
• Шифр специальности: 06.01.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 179 с. : ил.

 Используемые сокращения
Введение
Глава 1 Идентификация косточковых культур на основе
молекулярно-генетических маркеров
1.1 Типы молекулярно-генетических маркеров
1.2 Морфологические маркеры
1.3 Биохимические маркеры
1.4 Маркеры ДНК
1.4.1 11ГЬР - маркеры
1.4.2 ПЦР
1.4.3 ЛАРИ - маркеры
1.4.4 АББР - маркеры
1.4.5 ББЛ - маркеры
1.4.6 ГББЛ. - маркеры
1.4.7 Ретротранспозоны
1.4.8 БИР - маркеры
1.5 Выделение растительной ДНК
1.6. Подбор праймеров
Глава 2 Материалы и методы
2.1 Объекты исследования
2.2 Методы исследования
2.2.1 Выделение растительной ДНК
2.2.2 Амплификация ДНК
2.2.3 Электрофорез в агарозном геле и визуализация продуктов амплификации
2.3 Обработка результатов анализа
Глава 3 Результаты исследований и их обсуждение
3.1 Модификация протокола выделения ДНК из растений косточковых культур (слива, вишня, черешня)
3.2 Выбор праймеров
3.3 Идентификация косточковых культур
3.3.1 Идентификация сортов и ценных форм косточковых культур
3.3.2 Обнаружение гибридов косточковых культур
3.3.3 Кластерный анализ родственных связей косточковых культур
3.4 Характеристика эффективности праймеров и их комбинаций
3.5 Экономические затраты на проведение анализов для сортовой идентификации
3.6 Обсуждение результатов
Выводы
Рекомендации для практического использования
Список использованной литературы
ПРИЛОЖЕНИЕ А
ПРИЛОЖЕНИЕ В ПРИЛОЖЕНИЕ С ПРИЛОЖЕНИЕ D ПРИЛОЖЕНИЕ F
Используемые сокращения AFLP (amplified fragment length polymorphism) - полиморфизм длин амплифицированных фрагментов ДНК
АР - PCR (arbitrary primed PCR) - ПЦР с произвольным праймером (ПП -ПЦР)
ASAP (allele - specific associated reaction) - реакции, связанные с определенными аллелями
DAF (DNA amplification fingerprinting) - ДНК - амплифицированный фингерпринт
IRAP (inter - retrotransposon amplified polymorphism) - полиморфизм амплифицированных последовательностей между двумя рядом расположенными LTR ретротранспозона
ISSR (inter - simple sequence repeat) - полиморфизм между повторяющимися простыми последовательностями
LTR (long terminal repeat) - длинный терминальный повтор
МААР (multiple arbitrary amplicon profiling) - техника множественного
случайного ампликона
PCR (polymerase chain reaction) - полимеразная цепная реакция (ПЦР)
RAMD (random amplified monomorphic DNA) - случайно амплифицированная мономорфная ДНК
RAMP (random amplified microsatellite polymorphism) - произвольно амплифицированный микросателлитный полиморфизм RAPD (randomly amplified polymorphic DNA) - случайно амплифицированная полиморфная ДНК (САПД)
REMAP (retrotransposon - microsatellite amplified polymorphism) -полиморфизм амплифицированных последовательностей между фрагментом LTR ретротранспозона и праймером рядом расположенного простого микросателлитного повтора (SSR - праймера)
RFLP (restriction fragment length polymorphism) - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ)

Протокол выделения растительной ДНК с помощью набора реагентов Diatom DNA Prep 200:
1. Приготовление рабочего раствора Солевого буфера. Содержимое флакона с Солевым буфером переносили в мерный цилиндр, доводили бидистиллированной водой до метки 100 мл и 96%-ным этиловым спиртом до метки 300 мл и перемешивали.
2. В пробирку типа Эппендорф объемом 1,5 мл вносили 10-14 мг ткани -камбий, взятый с однолетних побегов (до метки 0,1 мл). Добавляли 400 мкл лзирующего буфера (применяли 5 систем буферов - смотри ниже) и гомогенизировали пробу до однородного состояния, используя пестик под пробирку Эппендорф. Перемешивали содержимое пробирки переворачиванием. В тех случаях, когда растительный материал сильно набухал, в пробирку дополнительно добавляли 200 мкл лизирующего реагента.
3. Термостатировали пробирку со смесью 40 минут при 65°С.
4. Затем центрифугировали пробирку со смесью 10 минут при 10000 об/мин. Прозрачный супернатант целиком переносили в чистую пробирку.
5. В пробирку добавляли 20 мкл суспензии сорбента NucleoS. Перед использованием сорбент интенсивно перемешивали до гомогенной суспензии на вортексе.
6. Содержимое пробирки с пробой перемешивали переворачиванием в течение 10 минут.
7. Центрифугировали 10 секунд при 10000 об/мин.
8. Осторожно, не задевая осадок, удаляли супернатант с помощью автоматической пипетки.
9. К осадку добавляли 200 мкл лзирующего реагента, тщательно перемешивали на вортексе до гомогенного состояния.
10. Добавляли в пробирку 800 мкл елевого буфера. Перемешивали содержимое переворачиванием пробирки.
11. Центрифугировали 10 секунд при 2000 об/мин.