Новые методические приемы разделения высокополярных соединений в практике ВЭЖХ

• Автор: Сапрыкина, Лидия Викторовна
• Шифр специальности: 05.11.11
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Краснодар
• Количество страниц: 134 с. : ил.

1. ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Бетаины

1.1.1. Строение бетаинов

1.1.2. Биологическая роль бетаинов

1.2. Состояние вопроса

1.3. Основные проблемы хроматографического анализа бетаинов

1.3.1. Детектирование

1.3.2.Выбор метода разделения

1.4. Динамическое модифицирование в ВЭЖХ

1.4.1. Общие положении

1.4.2.Ион-парный режим

1.4.3.Модифицирование ВЭЖХ-системы солями
1.4.4.Гидрофильный режим в ВЭЖХ
1.5. Подготовка биологических проб к анализу
1.5.1. Твердофазная экстракция
1.5.2. Методология твердофазной экстракции
1.5.3.Подбор типа картриджа
1.5.4.Кондиционирование картриджа
1.5.5. Подготовка пробы
1.5.6.Нанесенис пробы на сорбент
1.5.7.Промывка картриджа
1.5.8. Элюирование
1.5.9. Последующая обработка пробы
1.5.10. Дополнительные рекомендации
2. ГЛАВА 2 ПОДГОТОВКА И ХОД ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ РАБОТ
2.1 Оборудование
2.2 Материалы и реактивы
2.3 Пробоподготовка
2.4 Синтез гетероноверхностных сорбентов
2.5 Проведение хроматографического эксперимента
3. ГЛАВА 3. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ
РЕЗУЛЬТАТОВ
3.1 Применение ион-парного режима ВЭЖХ
3.2 Применение гидрофильной хроматографии
3.2.1 Методические подходы к оптимизации хроматографического разделения
3.2.2. Влияние природы органического растворителя
3.2.3.Влияние содержания модификатора в элюенте на хроматографическую систему
3.2.4. Нормально-фазовый вариант ДИРФ
3.3 Проявления режима ДИРФ нри анализе различных объектов
4. ДИНАМИЧЕСКОЕ МОДИФИЦИРОВАНИЕ В ПРАКТИКЕ ТСХ
ВЫВОДЫ ЮЗ
Методика определения бетаинов и мнлдроната в плазме крови с использованием. ТФЭ-очисткн и концентрирования (I)
Экспресс-методика одновременного определения четырех бетаинов и мнлдроната в плазме крови на гетсроноверхностном сорбенте (И)
5. ЛИТЕРАТУРА
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), интенсивно развиваясь несколько последних десятилетий, зарекомендовала себя в качестве одного из самых универсальных методов разделения и анализа веществ, что и обусловило ее необычайную популярность у исследователей в самых различных областях науки и техники [1-3].
Без использования ВЭЖХ сейчас невозможно представить практически ни одну отрасль промышленности и науки. А динамичное развитие таких направлений как экология, здравоохранение, фармакология и токсикология в наибольшей мере обязано именно аналитическим приложениям жидкостной хроматографии [4, 5].
В то же время, решая все более сложные аналитические; и препаративные задачи, сам метод непрерывно развивается как в-аппаратурном, так и в методическом плане.
Безусловно, в практическом плане для развития ВЭЖХ наиболее актуально появление новых хроматографических материалов, обладающих улучшенными разделительными характеристиками. Также весьма перспективны разработка и изучение новых методических приемов и режимов проведения хроматографического эксперимента. Особенно это значимо при разработке хроматографических методов разделения высокополярных веществ, в том числе - ионогенных. Необходимость анализа такого рода соединений в различных объектах появляется довольно часто при решении самых разнообразных научно-технических и технологических задач. Эти сорбаты являются традиционно сложными для разделения посредством классических режимов ВЭЖХ и предъявляют повышенные требования к качеству сорбентов и хроматографической аппаратуре [6-8].
Чаще всего используемые для осуществления таких анализов методические приемы, среди которых можно выделить реализацию ионпарного механизма разделения и предколоночную дериватизацию полярных компонентов пробы - далеко не всегда применимы [9-11].
Тем не менее, существует достаточно большое количество методов воздействия на хроматографическую систему, использующих динамическое (адсорбционное) модифицирование (ДМ), применение которого позволяет получать хорошие результаты на морально устаревших и относительно

дешевых сорбентах. К сожалению, среди многообразных приемов динамического модифицирования используются лишь некоторые, да и то бессистемно и неоправданно редко [12, 14, 15].
В последние годы все.чаще стали появляться публикации с описанием разделений веществ в режиме гидрофильной хроматографии так называемый HILIC-режим (аббревиатура от Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography), который предусматривает применение в хроматографической практике немодифицированного силикагеля вместе с полярными элюентами и значительно расширяет возможности ВЭЖХ [16].
Следует отметить, что применение этого весьма перспективного вида хроматографии также пока весьма ограничено, что обусловлено малой изученностью закономерностей процессов, протекающих на границе раздела фаз [17].
Одной из насущных проблем, представляющих значительные трудности при реализации ВЭЖХ-анализа, является определение органических оснований и амфолитов. Большинство этих веществ имеют исключительно важное значение для жизнедеятельности живых организмов любого уровня организации, поскольку либо являются биологически активными, либо непосредственно участвуют в биоэнергетических циклах.
Этот аспект делает задачу их надежного определения в биологических объектах очень актуальной применительно к таким важным отраслям, как биология, медицина, спорт, фармакология, токсикология и валеология.

Хроматограф Милихром позволяет создавать только ступенчатый градиент, для чего создавалась линейка из шести элюентов возрастающей силы от стартового (слабого) до конечного (сильного), которыми и заполняли элюентные виалы автосемплера прибора. Набор элюентов в шприцевой насос осуществляли последовательно по заранее заданной программе, что позволяет оперативно менять крутизну и форму градиента.
После монтажа в хроматограф предполагаемой к использованию колонки, через нее прокачивали до 10 объемов колонки элюента стартового состава. После выхода сигнала детектора на стабильный уровень базовой линии оборудование было готово к проведению исследований.
Объем вводимой пробы в зависимости от целей эксперимента составлял для микроколоночного варианта от 2 до 10 мкл, для аналитического - от 5 до 50 мкл. Скорость потока элюента для микроколонки устанавливали 100 мкл/мин (0,1 мл/мин), для аналитической колонки - 2 мл/мин. Реологические свойства элюента позволяли работать на микроколонках при давлении, непревышающем 3 МПа, а на аналитических колонках - 11 МПа.
В экспериментах использовали по несколько колонок одного типа с-идентичными хроматографическими свойствами, замену колонок проводили по мере потери ими приемлемой работоспособности и эффективности.
Поскольку хроматографы типа «Милихром» позволяют работать с малыми количествами растворителей, свободно изменять длину волны и снимать УФ-спектры соединений, элюирующихся из колонки, он был выбран нами в качестве основного при проведении предварительных экспериментов.
Выбор длины волны детектирования проводили, исходя из максимального отклика детектора на присутствие в элюенте целевых аналитов при небольшом уровне шумов и фонового поглощения элюента.
Съемка УФ-спектров чистых водных растворов бетаинов показала, что они обладают заметным поглощением в коротковолновой области УФ