Хроматографические методы идентификации и анализа аминированных метаболитов в микробиологических процессах

• Автор: Новикова, Анна Евгеньевна
• Шифр специальности: 05.11.11
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 225 с. : ил.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. МИКРОБНЫЙ СИНТЕЗ АМИНОКИСЛОТ

1.2. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТ И БИОГЕННЫХ

АМИНОВ

1.3. ВЭЖХ/МС АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТ И БИОГЕННЫХ АМИНОВ

1.4. АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТ С ПОМОЩЬЮ КЭ

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. РЕАКТИВЫ

2.2. ОБОРУДОВАНИЕ И МЕТОДЫ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ УСЛОВИЙ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО

РАЗДЕЛЕНИЯ НА УДЕРЖИВАНИЕ ХАК-ПРОИЗВОДНЫХ
3.1.1. Влияние концентрации органического модификатора на удерживание ХЛК-производных
3.1.2. Влияние неподвижной фазы используемых сорбентов на удерживание ХАК-производных
3.1.3. Влияние pH и концентрации буферного раствора на удерживание ХАК-производных
3.1.4. Связь строения ХАК-производных аминокислот с их удерживанием на обращенной фазе. Описание удерэ/сивания ХАК-производных на обращенной фазе с использованием моделей «удерживание — свойство» и «удерживание — строение»
3.2. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПАРАМЕТРОВ ИСТОЧНИКА МАСССПЕКТРОМЕТРА НА ИОНИЗАЦИЮ ХАК-ПРОИЗВОДНЫХ
3.2.1. Влияние параметров источника ионизации на масс-спектры ХАК-производных аминокислот
3.2.2. Влияние напряжения на конусе источника ионизации на масс-спектры ХАК-производных полиаминов и орнитина
3.3. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПАРАМЕТРОВ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ НА СКОРОСТЬ МИГРАЦИИ ДИКАРБОНОВЫХ И N-ЗАМЕЩЕННЫХ АМИНОКИСЛОТ
3.3.1. Влияние концентрации компонентов разделяющего буфера
3.3.2. Влияние приложенного напряжения на разделение исследуемых компонентов. Влияние времени инжекции на площадь пиков
аналитов
ГЛАВА 4. ПРИМЕНЕНИЕ РАЗРАБОТАННЫХ МЕТОДОВ
4.1. ИДЕНТИФИКАЦИЯ АМИНОКИСЛОТ И ПОЛИАМИНОВ В БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ
4.1.1. Идентификация и анализ ГАМК
4.1.2. Идентификация неканонических аминокислот
4.1.2.1. Идентификация и анализ норвалина и норлейцина
4.1.2.2. Идентификация примесей о-, м-, п- изомеров гидроксифенилаланина
4.1.2.3. Идентификация примеси гомоизолейцина
4.1.2.4. Идентификация 4-гидроксиизолейцина и 4-гидроксинорвалина
4.1.3. Идентификация дипептида валилвалин
4.1.4. Идентификация и анализ примеси путресцина
4.2. ПРИМЕНЕНИЕ КЭ ДЛЯ АНАЛИЗА ПРОДУКТОВ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ В РЕАКЦИОННЫХ СМЕСЯХ
4.2.1. Анализ глутаминовой кислоты
4.2.2. Определение N-ацетилглутаминовой и аргининоянтарной кислот
4.2.3. Анализ фосфорилированных продуктов ферментативных реакций
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ
Биотехнологический процесс является одним из основных способов получения биологически активных веществ, таких как аминокислоты, нуклеозиды, витамины и т.д [1 - 5]. В частности, микробиологический способ получения аминокислот отличается существенными преимуществами, так как позволяет синтезировать аминокислоты Ь-формы из относительно дешевых источников углерода. Аминокислоты секретируются в среду штаммами-продуцентами, способными к эффективному биосинтезу основного продукта в результате генетического конструирования. В процессе микробиологического синтеза целевой аминокислоты могут накапливаться сопутствующие аминированные метаболиты, образующиеся как в процессе биосинтеза, так и при деградации основного продукта. При разработке и оптимизации биотехнологического процесса необходимо контролировать не только количество целевого компонента и его известных метаболитов, но и отслеживать появление новых, не всегда предсказуемых примесей. Кроме того, аналитический контроль необходим и в процессе генетического конструирования штаммов-продуцентов для получения информации об изменении активностей ферментов, участвующих в биосинтезе целевого продукта.
Биотехнологические образцы, в частности культуральные жидкости штаммов-продуцентов, представляют собой сложные смеси, в составе которых содержатся компоненты исходной питательной среды, клетки микроорганизмов, продукты биосинтеза. Поэтому, при работе с реальными биологическими образцами целесообразно использовать комплексный подход, сочетающий высокоэффективные методы разделения, идентификации и количественного анализа соединений. Такими методами являются, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и капиллярный электрофорез (КЭ).
Следует отметить, что, используя метод ВЭЖХ, можно провести идентификацию соединений, используя только такую хроматографическую

Продолжение табл.З
8 82 % буферный раствор - 18 % ацстонитрнл в течение 30 мин, затем промывка колонки раствором 60 % ацетонитрил - 40 % вода и уравновешивание на начальных условиях. Скорость подвижной фазы 0,2 мл/мин и 0,8 мл/мин.
9 92 % буферный раствор — 8 % ацетонитрил, затем линейное увеличение ацетонитрила до 23 % за 35 мин, затем промывка колонки раствором 60 % ацетонитрил - 40 % вода и уравновешивание на начальных условиях. I Скорость подвижной фазы 0,3 мл/мин. |
В работе использована установка капиллярного электрофореза Quanta 4000 (Waters, США) снабженная ультрафиолетовым детектором с фиксированной длинной волны 254 нм и программным обеспечением для обработки хроматографических данных Мультихром 2.0 для Windows (Амперсенд, Россия). Разделение проводили в кварцевом капилляре с внутренним диаметром 75 мкм (Waters, США). Общая длина капилляра — 60 см, эффективная длина (до детектора) - 53 см. Использовали воздушное термостатирование капилляра при 20°С и гидростатический ввод образцов. Перед работой капилляр промывали 10 % раствором этанола в течение 1 минуты, деионизованной водой - 1 минуту, буферным раствором - 2 минуты. Между вводами образцов капилляр промывали 50 % раствором этанола в течение 2 минут, деионизованной водой - 1 минуту, буферным раствором - 2 минуты. После работы капилляр промывали деионизованной водой - 1 минуту, затем в течение 2 минут 10 % раствором этанола, которым консервировали капилляр.
Водородный показатель растворов контролировали с помощью рН-метра МР 225 (Mettler Toledo, Швейцария). В работе использовали центрифугу 5415D (Eppendorf, Германия) и ультразвуковую ванну 2510E-DTH (Bransonic, США).
Для получения производных аминокислот и полиаминов реагент 1-[[(6-хинолиниламино)карбонил]окси]-2,5-пирролидиндион готовили по стандартной методике растворением точной навески в ацетонитириле (3 мг/мл) [72, 76]. 1<[-[(6-хинолиниламино)карбонил]-производные (ХАКпроизводные) готовили непосредственно перед проведением эксперимента следующим образом (рис. 12): аликвоту модельной смеси или образца