Новые экспериментальные подходы к изучению фолликулогенеза in vitro и манипуляциям с преимплантационными эмбрионами млекопитающих

• Автор: Храмова, Юлия Владимировна
• Шифр специальности: 03.03.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 137 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ
1.1. Актуальность проблемы
1.2. Цели и задачи исследования
1.3. Научная новизна
1.4. Практическая и теоретическая значимость
1.5. Положения, выносимые на защиту
1.6. Апробация диссертации
1.7. Публикации по теме диссертации
1.8. Структура и объем диссертации
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Формирование и строение яичника млекопитающих
2.2. Фолликулогенез
2.2.1. Строение фолликулов и их классификация
2.2.2. Гормональная регуляция фолликулогенеза
2.2.3. Взаимодействие между компонентами фолликула
2.3. Экспериментальные подходы к изучению фолликулогенеза млекопитающих
2.3.1. Способы сохранения фертильности
2.3.2. Культивирование в 20условиях
2.3.3. Культивирование в 30 условиях
2.4. Лазерная микрохирургия клеток, ооцитов и эмбрионов
2.4.1. Мембранная хирургия
2.4.2. Фотопорация и трансфекция
2.5. Оптический пинцет
2.5.1. Принципы работы оптического пинцета
2.5.2. Применение системы оптического манипулирования к единичным клеткам
2.5.4. Проблемы, сопутствующие применению оптического пинцета
2.6. Биопсия ооцитов и преимплантационных эмбрионов
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Лабораторные животные
3.2. Получение биоматериала для эксперимента
3.2.1. Получение овариальной ткани и фолликулов
3.2.2. Получение преимплантационных эмбрионов
3.2.3. Выделение МСК КМ

3.3. Постановка экспериментов
3.3.1. Культивирование клеток и фолликулов
3.3.2. Сокулыпивирование фолликулов с клетками
3.3.3. Лазерная микрохирургия преииплантационпых эмбрионов
3.4. Анализ данных, полученных при проведении экспериментов
3.4.1. Цитологический анализ
3.4.2. Анализ объектов методом электронной микроскопии
3.4.3. Молекулярно-биологический анализ образцов
3.4.4. Измерения и статистический анализ данных
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
4.1. Подбор оптимальных условий для культивирования овариальных фолликулов in vitro
4.1.1. Культивирование овариальных фолликулов в 2D и 3D условиях
4.1.2. Культивирование овариальных фолликулов in vitro в 3D условиях в средах различного состава
4.2. Реконструкция соматического окружения первичного многослойного овариального
фолликула мыши
4.2.1. Сокулыпивирование овариальных фолликулов со смешанной первичной культурой
клеточных элементов стромы яичника мыши
4.2.2. Сокулыпивирование овариальных фолликулов с мезенхимными клетками стволовыми
клетками, выделенными из костного мозга мыши
4.2.3. Молекулярно-биологическое исследование реконструированных фолликулов
4.3. Подбор параметров лазерного воздействия на преимгшантационные эмбрионы мыши
4.3.1. Определение оптимальных параметров лазерного воздействия на
цитоплазматическую мембрану клеток эмбриона
4.3.2. Определение оптимальных параметров лазерного воздействия на цитоплазму
клеток эмбриона
4.3.3. Определение оптимальных параметров лазерного воздействия на оболочку
эмбриона мыши
4.4. Биопсия редукционного тельца
4.5. Биопсия трофэктодермы
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. ВВЕДЕНИЕ
1.1. Актуальность проблемы
Процесс формирования женских половых клеток - оогенез и сопряженный с ним фоллнкулогенез - сложный, многокомпонентный процесс, в регуляции которого участвуют многие системы организма. Изучению данного процесса как in vivo, так и in vitro посвящено большое количество работ как отечественных, так it зарубежных ученых. Особый интерес представляет динамика состояния клеточных элементов в составе овариального фолликула. Так было показано, что лютеинизнрованные клетки гранулезы под воздействием определенных факторов способны возвращаться в низкоднфференцированное состояние, о чем свидетельствовало появление маркеров стволовых и мезенхимных клеток, и впоследствии дифференцироваться в клеточные типы, не характерные для овариального фолликула (Kossowska-Tomaszczuk et al., 2009). Наряду с вопросами пластичности клеток в составе фолликула активно ведется изучение взаимодействия между клетками в составе фолликула (Zhang et al., 2014), а также со стволовыми клетками соматического окружения фолликулов (Kossowska-Tomaszczuk and De Geyter, 2013), так как считается, что именно они являются предшественниками теки (Tajima et al., 2007). Накопление сведений о поведении клеток в составе фолликула и динамике их развития и дифференцировки является не только фундаментальной интереснейшей задачей, но также имеет широкое практическое применение, так как позволит решить ряд вопросов, связанных с проблемой бесплодия.
В современной человеческой популяции бесплодие является широко распространенным недугом. По статистике Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) с данной проблемой сталкиваются не менее 15% супружеских пар репродуктивного возраста (Mascarenhas et al., 2012). В настоящее время для лечения бесплодия различной этиологии широко применяются методы вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) и за последние годы количество циклов экстракорпорального оплодотворения существенно возросло и к настоящему времени в мире после проведения данной процедуры родилось более 5 миллионов человек (Hyrapetian et al., 2014). Применяющиеся в настоящее время методы ВРТ основаны на введении пациентке гормональных препаратов для стимуляции фолликулогенеза с целью получения зрелых ооцитов. Однако гормональная стимуляция роста и созревания фолликулов противопоказана при целом ряде заболеваний, в том числе при всех онкологических процессах. Кроме того при использовании современных методов химиотерапии происходит фатальное снижение овариального резерва пациенток за счет повреждения пула примордиальных фолликулов

преантралыше фолликулы в условиях in vitro способны к росту (Amorim et al., 2009). Данная система также успешно используется при исследовании влияния факторов роста и гормонов на процессы фолликулогенеза in vitro, так, например, в работе Хэйсе и соавторов исследовали влияние ФСГ на рост преантральных фолликулов ювенильных крыс. В присутствии гормона как в растворе альгината, так и в среде для культивирования фолликулы увеличивались в диаметре до 20% по сравнению с контрольной группой (Heise et al., 2005). В раствор альгината до его полимеризации могут быть добавлены различные компоненты, оказывающие влияние на фолликулы, например, молекулы, которые входят в состав внеклеточного матрикса (коллаген I и II типа, ламинин, фибронектин). Эти компоненты оказывают влияние на соматические клетки в составе фолликула, стимулируя их пролиферацию и дифференцировку (Kreeger et al., 2006). Помимо альгинатных гидрогелей также применяют гидрогели на основе полиэтиленглнколя для культивирования преантральных фолликулов (Ahn et al., 2014). Авторы предлагают использовать полиэтиленгликоль для анализа влияния жесткости гидрогеля, создающего трехмерные условия культивирования, на рост фолликулов in vitro. В данном исследовании было показано, что жесткость субстрата не только влияет на темпы роста, но и регулирует созревание ооцита.
В последние годы большое внимание в работах, посвященных культивированию фолликулов in vitro, уделяется подбору оптимальных условий и оптимального состава сред. В экспериментах, поставленных разными исследовательскими группами, состав сред для культивирования существенно различается (табл.4). Разные авторы используют среды, различающиеся по процентному содержанию сыворотки, добавляемым ростовым факторам, наличию или отсутствию гормонов.
Таблица 4. Составы сред, используемых при культивировании овариальных фолликулов in vitro.
Объект культивирования Состав среды Ссылка на авторов исследования
Вторичные фолликулы мыши аМЕМ, 1% FCS (Jin et al., 2010)
Вторичные фолликулы мыши (150-163 мкм) аМЕМ, БСА, ФСГ, фетуин, ИТС (Hirshfeld-Cytron et al., 2011)
Фолликулы мыши (150 мкм) с сохраненным слоем теки и аМЕМ, NAHC03, пенициллин, стрептомицин, (Nayudu and Osbom, 1992)