Органотипическая культура сетчатки глаза как модель для оценки эффективности трансплантации клеток

• Автор: Сергеев, Сергей Александрович
• Шифр специальности: 03.03.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 179 с. : ил.

Оглавление
1. Введение

i 2. Обзор литературы

2.1. Строение и функциональные взаимосвязи сетчатки

„ 2.2. Развитие сетчатки

2.3.Регенерация сетчатки

2.3.1. Нейротрофнческие факторы в развитии и репарации сетчатки

2.4. Культуры клеток сетчатки и их применение

' 2.4.1. Первичные культуры сетчатки

? 2.4.2. Культуры ретииобластомы

> 2.4.3. Культуры, полученные генно-инженерными методами

i 2.5. Клеточная терапия дегенеративных заболеваний сетчатки
? 2.5.1. Ниша стволовых клеток
2.5.2. Пластичность стволовых клеток
2.5.3. Трансплантация клеток ПЭ в сетчатку глаза
2.5.4. Стволовые клетки мезенхимального происхождения
2.5.5. Нейральные стволовые/прогениторные клетки (НСПК)
3. Материалы и методы
3.1. Получение культур сетчатки
3.2. Нанесение повреждения
3.3. Получение и культивирование клеток для трансплантации
3.4. Атомно-силовая микроскопия1
3.5. Трансплантация клеток in vitro
3.6. Трансплантация клеток in vivo
3.7. Оценка результатов
3.7.1. Иммуногистохимический анализ
3.7.2. Морфологический анализ популяций клеток
3.7.3. Регистрация деполяризации мембраны трансплантированных клеток
3.7.4. Индекс площади
3.7.5. Вестерн-блот анализ
3.7.6. Сканирующая электронная микроскопия
3.7.7. Получение изображений
3.7.8. Статистический анализ
4. Результаты
4.1'. Морфологический анализ выселяющихся клеток эксплантатов сетчатки
4.2. Взаимодействие с трофическими факторами
4.3. Транспланатция клеток in vivo
4.4. Трансплантация клеток in vitro - использование эксплантационной культуры сетчатки как модели для прослеживания миграционной способности инъецированных клеток
4.4.1. Поведение ММСК, трансплантированных в эксплантат сетчатки
4.4.2.Поведение НСПК, трансплантированных в эксплантат сетчатки
4.4.2. Поведение клеток ПЭ, трансплантированных в эксплантат сетчатки
4.5. Исследование последствий трансплантации НСПК и ММСК в органотипическую культуру сетчатки глаза, поврежденную инфракрасным лазерным излучением in vitro
4.5.1. Возможность функциональной репарации нейросетчатки с использованием трансплантации клеток
5. Обсуждение

5.1. Морфологический анализ выселяющихся клеток эксплантатов сетчатки
5.2. Взаимодействие с трофическими факторами
5.3. Трансплантация клеток - использование эксплантационной культуры сетчатки как модели для исследования миграционной активности инъецированных клеток
5.4. Исследование последствий трансплантации НСПК и ММСК в органотипическую культуру сетчатки глаза, поврежденную инфракрасным лазерным излучением
5.4.1. Возможность функциональной репарации нейросетчатки с использованием трансплантации клеток
6. Выводы
7. Литература

1. Введение
Возможность направленной и контролируемой дифференцировки стволовых клеток является одной из наиболее актуальных задач современной биологии развития. Накопленные к настоящему времени данные по решающему значению микроокружения для дальнейшего развития трансплантированных стволовых клеток позволили применить принципиально новые подходы для- их терапевтического введения; а публикации-, по трансдифференцировке одних клеточных типов в. другие открывают широкие перспективы к репарации повреждений*- тканей; с использованием клеточной терапии [Hill et al., 2008]. Существует два подхода к лечению нейродегенеративных заболеваний; нашедшие широкое применение в нейрохирургии головного мозга и интенсивно внедряющиеся.в офтальмологию [Kretz et al, 2004]. Первый заключается в стимуляции собственных резервных механизмов репарации сетчатой- оболочки [Zhang et al., 2002] под действием- нейротрофических факторов, инъецируемых в непосредственной близости- от возникшего дефекта. Второй - в. трансплантации малодифференцированных (стволовых/прогениторных) ‘[Рагтаг, 2002] или. высокоспециализированных [Ming et al., 2009] клеток в-место повреждения; Несмотря на значительные методологические отличия этих подходов, их терапевтическое действие достаточно сходно. В обоих случаях в область дегенерации нервных клеток вводятся трофические факторы, обладающие нейропротекторным действием и стимулирующие резидентные стволовые клетки к пролиферации. В случае введения белковых препаратов - это прямая доставка факторов роста, при трансплантации клеток — это доставка опосредованная инъецированными клетками, секретирующими коктейль факторов в окружающую среду.
Оба подхода имеют свои преимущества и недостатки. Так, при
введении факторов роста происходит их быстрое прониконовение в область
повреждения, приводящее к минимизации развития острой дегенерации.
Однако вводимые белковые молекулы либо их комплексы подвержены*

реципиента. Однако описанные способы трансплантации не позволяет использовать объемы среды содержащей клетки более 2мкл. Вместе с этим, супраретинальный способ трансплантации чрезвычайно сложен в исполнении и достаточно травматичен, кроме того всегда есть значительная вероятность повреждения сетчатки при такой инъекции. При супраретинальной трансплантации процент мигрирующих клеток снижается из-за наружной ограничивающей мембраны глаза и контактов мюллеровских клеток.
Процедуры клеточной терапии, направленные на восстановление зрения можно разделить на два типа: клеточная терапия для' осуществления нейропротекторной функции и терапия для восстановления клеток при нейродегенеративных повреждениях сетчатки. В первом случае применяют клетки ПЭ, либо ММСК, которые оказывают системное нейропротекторное действие, секретируют различные факторы и сопосбствуют запуску собственных систем репарации ткани. Во втором - заместительную клеточную терапию с целью внесения в очаг повреждения клеток, способных возместить утраченные нейроны - предшественники ганглиозных клеток и НСПК [Bull, Martin 2011].
При трансплантации крысам нейрональных прогениторных клеток
области гиппокампа было обнаружено, что только у 50% животных
происходила активная миграция и встраивание донорских клеток в состав
внутреннего ядерного слоя нейросетчатки [Young et al., 2000]. В то же время,
при повреждении сетчатки, активировались процессы распространения и
встраивания трансплантированных клеток и большинство клеток донора
детектировали во всех слоях сетчатки [,Kurimoto et al., 2001; Nishida et al
2000; Takahashi et al., 1998; Chacko et al., 2003; Grozdanic et al., 2006].
Аналогичные результаты были получены и при инъекции в глаз
эмбриональных стволовых клеток [Нага et al., 2000]. Стволовые клетки,
которые встроились в слои сетчатки, начинали экспрессировать маркеры
дифференцировки, характерные для своего нового микроокружения, в том