Исследование мутаций leg-arista-wing complex, нарушающих экспрессию фактора транскрипции TRF2 в эмбриогенезе Drosophila melanogaster

• Автор: Бурдина, Наталья Владимировна
• Шифр специальности: 03.03.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 112 с. : ил.

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Эмбриональное развитие дрозофилы

1.2. Генетический контроль эмбрионального развития дрозофилы

1.2.1. Формирование вентральной борозды

1.2.2. Удлинение и сокращение зародышевой полоски

1.2.3. Спинное закрытие

1.2.4. Развитие трахеи

1.3. Роль поляризации эпителиальных клеток в морфогенетическом движении

1.3.1. Гены, определяющие план строения организма вдоль переднезадний оси, контролируют поляризованное поведение клетки

1.4. Характеристика гена leg-arista-wing complex

1.5. Фактор базовой транскрипции TRF2
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Методы содержания дрозофилы и манипулирования с ней
2.2. Генетические методы
2.3. Флуоресцентная микроскопия и фотографирование
2.4. Молекулярные методы
2.5. Получение трансгенных конструкций
2.6. Получение трансгенных линий D. melanogaster

Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Определение стадии летальности мутантов в линиях, содержащих /тгс-аллели
3.2. Анализ препаратов кутикулы погибших эмбрионов из линий с мутациями, нарушающими экспрессию укороченной изоформы белка Т11Р2
3.3. Анализ препаратов кутикулы погибших эмбрионов из линий с мутациями, нарушающими экспрессию полноразмерной изоформы белка ТШ
3.4. Анализ препаратов кутикулы погибших эмбрионов линий с мутациями, нарушающими экспрессию >1-концевого домена белка ТКР2
3.5. Исследование материнского эффекта 1аюс1ТгУ2
3.6. Исследование молекулярной природы аллелей гена 1сгмс/Тг/2
Глава 4. Заключение
Выводы
Список литературы
Приложение

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Эмбриогенез дрозофилы является привлекательной модельной системой для изучения морфогенеза. Морфогенетические события, охарактеризованные у дрозофилы, имеют много общего с механизмами, контролирующими морфогенетические процессы у позвоночных животных. Например, морфогенез во время спинного закрытия (‘dorsal closure’) у эмбриона дрозофилы схож с процессами эпиболии и ранозаживления у позвоночных животных. Считается, что эти морфогенетические процессы происходят благодаря ведущим эктодермальным краевым клеткам, в которых происходит экспрессия ряда определённых генов. Эмбриональное ранозаживление позвоночных животных, в отличие от ранозаживления взрослых особей, происходит без формирования рубца и является примером феномена подобного спинному закрытию дрозофилы (Martin, 1997). В настоящее время ведётся активный поиск генов-участников этого процесса, а дрозофила при этом выступает в качестве удобного модельного объекта.
Другим морфогенетическим событием эмбриогенеза дрозофилы является инвагинация мезодермы в вентральной борозде (Pilot, Lecuit, 2005). Во время гаструляции у части вентральных мезодермальных ирекурсорных клеток происходит высоко скоординированное сокращение (сжимание) апикальной поверхности. Это событие способствует сначала инвагинации, а затем и формированию трубки, состоящей из клеток вентральной борозды. У эмбриона мыши смыкание нервной трубки зеркально отражает формирование вентральной борозды дрозофилы. Эти факты позволяют предположить, что молекулярные программы, лежащие в основе таких событий, как спинное закрытие и формирование вентральной борозды, консервативны и повторно использовались в эволюции.
Сейчас хорошо описаны отдельные изменения формы клеток, свойственные каждому морфогенетическому процессу, однако, недостаточно изучена роль конкретных факторов транскрипции, активирующих

Основу сигнального пути PCP составляют три белка, ассоциированных с клеточной поверхностью - Frizzled, Strabismus (или Van Gogh), Flamingo (или Starry night), и три цитоплазматических белка - Dishevelled, Prickle, Diego (рис. 8). Flamingo локализуется в клетке проксимально и дистально (Usui et al., 1988), тогда как Frizzled, Dishevelled и Diego - только дистально (Axelrod, 2001; Das et al., 2004), a Prickle и Strabismus - только проксимально (Tree et al., 2002; Bastock et al., 2003). Flamingo является атипичным кадгерином со семью трансмембранными доменами. Frizzled также имеет семь трансмембранных доменов, a Strabismus - четыре. В состав цитоплазматического белка Dishevelled входят домены DIX (Dishevelled-Axin), PDZ (PSD-95, Discs large, ZO-1) и DEP (Dishevelled, EGL-10, Pleckstrin). Цитоплазматический белок Prickle (известный также как Spiny legs) имеет один PET-домен и три LIM-домена. Цитоплазматический белок Diego несёт шесть анкириновых повторов. Было показано, что Frizzled может напрямую взаимодействовать с Dishevelled, a Strabismus - с Prickle. Кадгерин Flamingo, который опосредует гомофил ьную адгезию, рекругирует остальные коровью белки PCP в районы адгерентных связей (Strutt, 2002).
Как происходит асимметричное распределение белков PCP, показали Шимада с соавторами (Shimada et al. 2006): во время раннего развития крыла микротрубочки выстраиваются вдоль проксимально-дистальной оси, параллельно апикальной поверхности клетки. Проводя исследования с использованием зелёного флуоресцентного белка (GFP), они увидели, что гибридный белок Frizzled: GFP предпочтительно транспортируется в дистальном направлении и находится в везикулах, которые также содержат Flamingo. Авторы обратили внимание на то, что этот транспорт похож на зависимое от микрогрубочек движение везикул, содержащих белок Dishevelled, которое ранее наблюдали в яйце шпорцевой лягушки Xenopus laevis (Miller et al., 1999). Оказалось, что везикулы, содержащие Flamingo, тоже ассоциированы с микротрубочками, разрушение которых приводит к исчезновению Frizzled и Flamingo с поверхности клетки и нарушению