Модель генетического нокдауна соматического цитохрома с мыши

• Автор: Шилов, Евгений Сергеевич
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 97 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОПРЕДЕЛЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Место цитохрома с в регуляции процессов жизнедеятельности клетки

1.2 Цитохром с, вариабельность его структуры и связанные с ним генетические модели

1.3 Значение процессов, в которых участвует цитохром с, для различных клеток иммунной системы

1.4 Избирательное редактирование генома в определенных

типах клеток ш г/го и генетические модели

митохондриальных заболеваний

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Материалы
2.2 Методы клеточной биологии
2.3 Методы молекулярной биологии
2.4 Статистическая обработка данных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Описание модели с различными вариантами кондиционного нокдауна гена Сусх
3.2 Влияние снижения количества цитохрома с на жизнеспособность мышей
3.3 Определение механизма снижения количества цитохрома с и оценка
этого количества в клетках иммунной системы
3.4 Анализ жизнеспособности цитохромдефицитных лимфомиелоидных клеток
3.5 Влияние снижения количества цитохрома с на клеточный метаболизм и апоптоз
3.6 Проверка иммунных функций цитохромдефицитных макрофагов
3.7 Обсуждение дыхательной функциональности
цитохромдефицитных клеток
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОПРЕДЕЛЕНИЙ
АФК - активные формы кислорода
АТФ - аденозинтрифосфат
МЭФ - мышиные эмбриональные фибробласты
ПЦР - полимеразная цепная реакция
п.н. - пары нуклеотидов
ФНО (TNF) - фактор некроза опухолей
ЭПР - эцдоплазматический ретикулюм
BCR - В-клеточный рецептор
CD - cluster of differentiation - поверхностные молекулы лейкоцитов CDP - commited dendritic progenitor -коммитированый предшественник миелоидных дендритных клеток
DN - double negative - тимоцит, не имеющий на своей поверхности маркеров CD4 и CD
MPT - mitochondrial penneability transition - переход к пермеабилизации митохондрий
NADH - востановленный никотинамидаденозиндинуклеотид
ТЫС - тромбоцитопения
wt - wild type (аллель дикого типа)
Остатки аминокислот в зависимости от контекста обозначены трехбуквенными либо однобуквенными сокращениями Дни мышиного онтогенеза: Е - эмбриональный период, Р -постнатальный период
Генетический нокаут - удаление гена-мишени либо полное подавление его функции.
Г енетический нокин - нуклеотидная замена последовательности гена-
мишени, приводящая к изменению аминокислотной последовательности
кодируемого белка.
Генетический нокдаун — снижение экспрессии гена-мишени с
сохранением его кодирующей последовательности.

Линия с Юх?-фла,чкировэнным ГекОМ -М*»Ш“НЫ>

ЛМИЯЯ С реКО»6«М39СЙ ЛОД ИОКГПОЛГЧИ тчачестецифичесхого промстсра
Пр> сединаховсм сриеитацил toxP про«сходнт деления
а поколении F2 - новая линия, в которой rew-мишень уделяется в определенней тквнв или популяции «леток
5 - ATAACTTCGTATA : АЗС^АГЯС

TATACGAAGTTAT-3'
При встречной ориентации LoxP происходит инверсия

3' - Т ATT GAAGC АТ АТ : i АТАТ GCTT С ДАТ А -5‘
Последовательность чучяеотйцев LoxP, узнаваемая рекшибиназойСге
Рисунок 7. Принцип кондиционного редактирования гена с использованием тканеспецифической сге-рекомбиназы (по Kuhn and Wurst, 2009 с изменениями).
Обозначены схема скрещивания, последовательность LoxP-сайта и ориентация LoxP для делеции или инверсии LoxP-фланкированной последовательности.
Помимо мышей с различными вариантами рекомбиназы Сге для специфического удаления генов-мишеней можно применять мышей с рекомбиназой Flp, впервые открытой на двухмикронной плазмиде почкующихся дрожжей (Dymecki, 1996). Кроме рекомбиназ для высокоточного редактирования геномов у эукариот можно использовать также генноинженерные высокоспецифические нуклеазы, специфичность которых задается с помощью ДНК-связывающих доменов типа «цинковый палец» (Santiago et al., 2008), ДНК-связывающих TAL-доменов бактерии Xanthomonas (Li et al., 2011) или комплементарно связывающейся с ДНК гена мишени гидовой РНК, направляющей бактериальную нуклеазу Cas9 (Ran et
Мыши с тканеспецифическими нокаутами и нарушениями экспрессии генов широко используются как собственно для физиологических исследований, так и дня создания животных моделей заболеваний человека. При этом следует отметить, что для манипуляций при помощи высокоспецифических рекомбиназ доступен ядерный геном, однако недоступна митохондриальная ДНК. Митохондриальные заболевания человека преимущественно связаны с компонентами дыхательной цепи, гены
al., 2013),