Структурно-функциональные различия цитоплазматических изоформ актина в немышечных клетках

• Автор: Дугина, Вера Борисовна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 235 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

История вопроса и актуальность темы исследования

Цель и задачи исследования

Сопоставление полученных результатов с мировым уровнем

Методы исследования

Научная новизна, теоретическая и практическая значимость

Степень достоверности и апробация результатов

Положения, выносимые на защиту

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Актин
1.1. Структура молекулы актина и стадии образования полимера
1.2. Построение различных сетей актиновых филаментов
1.3. Механические свойства актинового цитоскелета
2. Актин-связывающие белки, образующие различные актиновые структуры
3. Основные сигнальные пути, регулирующие построение актиновых структур
3.1. Семейство Rho ГТФаз
3.2. Rho ГТФазы и актиновый цитоскелет
3.3. ERK-MAPK каскад и актиновый цитоскелет
3.4. Фосфатазы, выполняющие функцию опухолевых супрессоров
4. Контакты фибробластов с внеклеточным матриксом
5. Компоненты внеклеточного матрикса
6. Межклеточные контакты
7. Изоформы актина
8. Регуляция экспрессии изоформ актина
9. Функции актиновых изоформ
9.1 Локализация и распределение изоформ актина
9.2. Саркомерные актины
9.3. Гладкомышечные актины (SMA)
9.4. Цитоплазматические актины (CYAs)
10. Реорганизация актина при неопластической трансформации
11. Эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП)
12. МАРК в опухолевой прогрессии

12.1. Сигнальные каскады МАРК
12.2 Роль ЕШС1/2 сигнального пути при ЭМП III типа
12.3 Окислительный стресс, МАРК сигнальные пути и ЭМП
13. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ОСНОВНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Культивирование клеток и реагенты
2. Иммунофлуоресценция. Световая микроскопия
3. Фазово-контрастная и интерференционно-отражательная микроскопия
4. Морфометрия клеток
5. Морфометрия фокальных контактов (ФК)
6. Иммунофлуоресценция и Лазерная Сканирующая Конфокальная микроскопия
7. Трансфекция малыми интерферирующими РНК (вШИА)
8. Трансфекция ЕСЕР- конструкциями и ретровирусными конструкциями
онкогенов ЯАБ
9. Морфометрия клеток в экспериментах с ьіІША
10. Прижизненная микроскопия после зіЮЧА трансфекции
11. Характеристика антител к изоформам актина
12. Электрофорез белков и иммуноблоттинг
13. Статистический анализ
14. Сравнительное иммуноморфологическое исследование нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека
15. Сравнительное иммуноморфологическое исследование нормальной и опухолевой ткани шейки матки человека
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Часть 1. Исследование цитоскелетных характеристик и организации адгезионных структур а-БМА - позитивных и а-8МА - негативных культивируемых крысиных фибробластов различного органного происхождения
1.1. Морфометрия а-БМА - позитивных и а-БМА - негативных клеток в популяциях фибробластов различного происхождения
1.2. Цитоскелетные структуры и фокальные контакты (ФК) у а-БМА - позитивных и а-БМА - негативных клеток в популяциях фибробластов различного происхождения

1.3. Организация клеточного БХ у а-БМА — позитивных и а-БМА - негативных клеток в популяциях фибробластов различного происхождении
1.4. Прижизненное изучение влияния экспрессии а-БМА на псевдоподиальную активность фибробластов
1.5. ОБСУЖДЕНИЕ. Сравнительные цитоскелетные характеристики и организация адгезионных структур у а-БМА-позитивных и а-БМА-негативных клеток в культурах крысиных фибробластов различного органного происхождения
Часть 2. Динамическая молекулярная организация контактов клетки с внеклеточным матриксом при модуляциях экспрессии а-БМА
2.1. Роль а-БМА изоформы в эволюции ФК
2.1.1. Анализ разнообразия и характеристика категорий ФК
2.1.2. Биохимическая характеристика ФК-ассоциированных белков
2.1.3. Действие рекомбинантного фрагмента клеточного фибронектина гЕБ-А и блокирующих антител на организацию БЫ сети и созревание ФК
2.1.4. гЕБ-А связывается с полимеризованным БЫ
2.1.5. Влияние актомиозиновой сократимости на структуру
стресс-фибрилл и ФК
2.1.6. Суперсозревание ФК зависит от повышенной сократимости, связанной
с экспрессией а-БМА
2.1.7. Действие ингибиторов МЕК1 и р38 на полимеризацию ЕЙ и
экспрессию а-БМА
2.1.8. Индукция миофибробластной дифференцировки с помощью митохондриально - направленных антиоксидантов
2.2. ОБСУЖДЕНИЕ
2.2.1. Функция а-БМА связана с модуляцией ФК при дифференцировке фибробластов в миофибробласты
2.2.2. Формирование фибрилл Б14 под действием ТСБр
2.2.3. Роль рЗ8 в полимеризации Б1Ч и модуляции миофибробластов
2.2.4. Равновесие натяжения, определяемого актомиозиновым цитоскелетом,
и устойчивостью внеклеточного матрикса в суперзрелых ФК
Часть 3. Исследование организации и распределения цитоплазматических актинов в немышечных клетках
3.1. Характеристика тАБв к (3- и у-СУА

активности белков семейства Rho (Yoshizaki et al., 2003; Hodgson et al., 2010), позволило напрямую исследовать локализацию и взаимосвязи белков этого семейства. Оказалось, что Rho и Rac активности не сегрегированны в клетке, как ранее предполагалось, а обе локализуются в протрузиях на ведущем крае клетки (Machacek et al., 2009). Возможно, это отражает периодические процессы протрузии и ретракции, происходящие на ведущем крае при движении клетки.
Активная, ГТФ-связанная, форма малой ГТФазы RhoA является ключевым регулятором образования акто-миозинового сократимого кольца при клеточном делении. RhoA концентрируется в анафазном экваториальном кортексе клетки, в местах зарождения митотической перетяжки. Во время цитокинеза RhoA активируется RhoGEF, ЕСТ2, а также другими RhoA-активирующими белками GAP. Активированный RhoA промотирует нуклеацию, элонгацию и скольжение актиновых филаментов с помощью координированной активации форминов и миозин II моторов (Glotzer, 2005; Kamijo et al., 2006; Piekny et al., 2005; Piekny, Glotzer, 2008).
Миграция опухолевых клеток в процессе инвазии и метастазирования связана со сложными регуляторными процессами. В движении опухолевых клеток принимают участие разные сигнальные пути, их сочетание в зависимости от типа опухоли и внеклеточных условий. В связи с этим, активно изучаются члены семейства Rho малых ГТФаз и МАРК (митоген-активируемых протеинкиназ). Сигнальные компоненты, предположительно наиболее важные для опухолевых миграционных процессов, согласно литературным данным, многочисленны и зависят от предпочтений авторов. Различия в вовлеченных сигнальных путях часто зависят от типа клеток и физиологических условий. Например, анализ миграции и инвазии клеток рака молочной железы человека только одной линии MDA-MB-231 в ответ на различные стимулы, выявил вовлечение различных сигнальных путей. Оказалось, что LPA, потенциальный стимулятор Rho-ROCK сигнального пути, не использует Rho-ROCK путь для стимуляции миграции, а вместо этого использует Rac и МАРК. Напротив, для LPA-стимулируемой инвазии необходимы Rho, Rac и МАРК. Из этих трех основных сигнальных путей, для стимулируемой EGF миграции клеток MDA-MB-231 необходим сигнальный путь Rho, Rac нужен только для инвазии, а МАРК - для миграции. Интересно, что HGF/SF активация приводила к вовлечению одних и тех же путей для миграции и инвазии, для которых требовался Rho, а не Rac сигнальный путь. Наконец, как и предполагалось, киназа легкой цепи миозина (MLCK) - точка схождения сигнальных путей для МАРК и Rho семейства ГТФаз, была необходима при всех изучаемых условиях. Таким образом, в подвижности опухолевых клеток принимают участие множественные сигнальные пути, а участие отдельных