Адгезионная и транскрипционная функции β-катенина в самообновлении эмбриональных стволовых клеток мыши

• Автор: Синева, Галина Сергеевна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 106 с. : ил.

Оглавление

Список используемых сокращений

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Цели и задачи исследования

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Эмбриональные стволовые клетки: регуляция самообновления и плюрипотентности

1.1 Происхождение и свойства ЭСК

1.2 Транскрипционные факторы, регулирующие плюрипотентность и самообновление ЭСК

1.3 Сигнальные пути, регулирующие самообновление и плюрипотентность ЭСК

1.4 Особенности регуляции клеточного цикла ЭСК мыши

1.5 Индукция дифференцировки ЭСК
2. Адгезионная и транскрипционная функции р-катенина
2.1. Р-катенин и его роль в каноническом Wnt-сигнальном каскаде и межклеточной адгезии
2.2. Функции р-катенина в эмбриогенезе, клеточной пролиферации и дифференцировке
2.3. Роль Р-катенина и его партнеров в регуляции плюрипотентности, самообновления и дифференцировки
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Культивирование клеток
МТТ-тест и кривые роста
Временная трансфекция и анализ люциферазной активности
Проточная цитофлуориметрия на содержание ДНК
Анализ активности каспаз in vitro
Иммунофлуоресценция
Экстракция тотального белка в денатурирующих условиях и Вестерн блоттинг 46 Экстракция белка для иммунопреципитации и осаждения GST-E-кадгерином
Экстракция РНК и ОТ-ПЦР
РЕЗУЛЬТАТЫ
Общая характеристика активности р-катенина и экспрессия его коактиваторов в
недифференцированных мЭСК и при дифференцировке
Уровень экспрессии, локализация и транскрипционная активность р-катенина
при инактивации GSK3 в недифференцированных мЭСК
Влияние инактивации GSK3 на Р-катенин-зависимую адгезию в
недифференцированных мЭСК
Регуляция маркеров ЭМП при инактивации GSK3 в недифференцированных
мЭСК и при дифференцировке
Влияние ингибиторов GSK3 на выживаемость, пролиферацию и экспрессию
регуляторов клеточного цикла в мЭСК
Влияние инактивации GSK3 на экспрессию фактора REST в мЭСК
Модуляция экспрессии и активности Р-катенина ингибитором MEK/ERK
каскада
ОБСУЖДЕНИЕ

Активность р-катенина в недифференцированных мЭСК и при дифференцировке

Адгезионный пул Р-катенина и межклеточная адгезия
Сигнальный пул р-катенина и избирательная активация транскрипции
Модуляция экспрессии и активности р-катенина ингибитором МЕК/ЕЛК
каскада
Влияние ингибиторов ОБКЗ на выживание и пролиферацию мЭСК
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Список цитированной литературы
БЛАГОДАРНОСТИ
Список используемых сокращений
АРС adenomatous poliposis coli
ВЮ (2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-oxime
ВМР4 bone morphogenetic protein
СВР CREB (cAMP response element-binding protein) binding protein
CDK cyclin-dependent kinase
CHIR CHIR99021
СК1 casein kinase
DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole
Dvl Dishevelled
DMSO dimethylsulfoxide
EGFR epidermal growth factor receptor
eIF4F eukaryotic initiation factor 4F
ERK extracellular signal-regulated kinase
FCS fetal calf serum
FGF fibroblast growth factor
GAPDH глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа
GSK3 glycogen synthase kinase
GST глутатион-8-трансфераза
HGFR hepatocyte growth factor receptor
HDAC hystone deacetylase
IL6 interleukin
JAK Janus-associated kinase
Klf Kriippel like factor
Lef lymphoid-enhancer-factor
LIF leukemia inhibitory factor
LIFR LIF receptor
LRP5/6 Iow-density lipoprotein receptor-related protein 5/6
МАРК mitogen-activated protein kinase
MEK mitogen activated protein kinase kinase
mTOR mammalian target of rapamycin

Wnt каскада определяет выбор направления дифференцировки клеток-предшественников нервного гребня, вызывая их превращение в сенсорные нейроны и меланоциты, а также стволовых клеток кожи, которые в присутствии сигнала от ß-катенина приобретают способность формировать волосяной фолликул, а в отсутствие такового дифференцируются в клетки эпидермиса (Hari et al., 2002; Huelsken, Birchmeier, 2001). Факторы Wnt стимулируют образование остеобластов из мезенхимных предшественников (Gaur et al., 2005), направляют миоцитарную дифференцировку стволовых клеток при регенерации мышц, поддерживают нейральную дифференцировку на поздних этапах формирования центральной нервной системы (ЦНС) (Kleber, Sommer, 2004; Чуйкин и др., 2007). Напротив, на более ранних стадиях развития сигналы от молекул Wnt необходимы для нормальной пролиферации стволовых клеток в ЦНС. В частности, для клеток-предшественников гипофиза функция ß-катенина заключается в последовательной активации транскрипции Pitx2 и CyD2, что положительно сказывается на прохождении клеток по клеточному циклу (Wang, Winshaw-Boris, 2004). В зрелых тканях ß-катенин-зависимая транскрипция поддерживает пролиферацию стволовых клеток кишечника, кожи, а также адипоцитов и гематопоэтических стволовых клеток, сохраняя их популяцию на необходимом постоянном уровне (Kleber, Sommer, 2004; Pinto et al., 2003). Значение Wnt-сигнального пути для процессов пролиферации стволовых клеток тканей позволяет понять, почему дерегуляция этого каскада часто ассоциирована с возникновением опухолей. Опухолеобразование может являться следствием стабилизации и накопления ß-катенина и повышенной активности TCF/ß-катенин-содержащих комплексов. До 80% опухолей кишечника содержат мутации гена АРС, ряд других опухолей содержит мутации по тем аминокислотным остаткам ß-катенина, которые в норме являются сайтами фосфорилирования киназой GSK3ß (Morin, 1999).
Таким образом, один и тот же сигнальный каскад выполняет множество разнообразных, порой противоположных, функций (например, запуск дифференцировки - или ее запрет и поддержание пролиферации). Очевидно, эффект активации Wnt пути зависит от того молекулярного контекста, в котором она происходит. Клетки разных типов, или клетки, находящиеся на разных стадиях развития или в разных микроокружениях (например, ранние и поздние стволовые