Факторы роста из семейств факторов роста эндотелия сосудов и факторов роста фибробластов, Si-VEGF2 и Si-FGF, и их рецепторы в онтогенезе морского ежа Strongylocentrotus intermedius

• Автор: Кипрюшина, Юлия Олеговна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 128 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
FJIABА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1Л. Факторы роста и их рецепторы
1ЛЛ. Фактор роста эндотелия сосудов и его
рецептор
1Л Л Л. Фактор роста эндотелия сосудов
1ЛЛ.2. Рецептор фактора роста эндотелия сосудов
1ЛЛ.З. Биологические функции фактора роста эндотелия
сосудов
1Л .2. Фактор роста фибробластов и его рецептор
1Л.2Л. Фактор роста фибробластов
1Л .2.2. Рецептор фактора роста фибробластов
1.1.2.3. Биологические функции фактора фибробластов
1.2. Строение и развитие морского ежа
1.2.1. Эмбриональное развитие морского ежа
1.2.2. Постэмбриональное развитие морского ежа
1.2.3. Строение взрослого морского ежа
1.2.4. Роль факторов роста в онтогенезе иглокожих
1.3. Сурамин - неспецифический ингибитор рецепторов факторов роста
1.4. Дифференцировка клеток морского ежа в культуре
ЕЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Нерест и искусственное оплодотворение морского ежа
2.2. Анализ экспрессии генов факторов роста и рецепторов факторов роста у морского ежа
2.2.1. Дизайн праймеров
2.2.2. Выделение РНК из эмбрионов, личинок, а также клеток, тканей и органов взрослых особей морского ежа
2.2.3. ОТ-ПЦР
2.2.4. Условия проведения ПЦР
2.2.5. ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (З'-RACE и 5'-RACE ПЦР)
2.2.6. Электрофорез продуктов ПЦР-анализа
2.2.7. Секвенирование ДНК
2.3. Филогенетический анализ белков семейств VEGF и PDGF
2.4.Еибридизация in situ
2.4.1. Синтез зонда для гибридизации in situ
2.4.2. Фиксация материала и условия проведения гибридизации in situ
2.5. Эксперименты по ингибированию взаимодействия факторов роста и
их рецепторов в эмбриогенезе морского ежа
2.6. Световая микроскопия
2.7. Получение и анализ первичной культуры клеток из эмбрионов морского ежа
2.7.1. Получение первичной культуры клеток из эмбрионов морского ежа и индукция спикулогенной дифференцировки
2.7.2 Определение активности щелочной фосфатазы
2.8. Статистический анализ полученных результатов
ЕЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Филогенетический анализ белков из семейств VEGF и PDGF
3.2. Экспрессия генов Si-Veg/2 и Si-Vegfr в онтогенезе морского ежа S. intermedius
3.2.1. Экспрессия генов Si-Vegf2 и Si-Vegfr в раннем развитии морского ежа S. intermedius
3.2.2. Экспрессия генов Si-Vegf2 и Si-Vegfr в клетках, тканях и органах взрослого морского ежа S. intermedius

3.3. Экспрессия генов Si-Fgf и Si-Fgfr в онтогенезе морского ежа S. intermedins
3.3.1. Экспрессия генов Si-Fgf и Si-Fgfr в раннем развитии морского
ежа S. intermedius
3.3.2. Экспрессия генов Si-Fgf и Si-Fgfr в клетках, тканях и органах
взрослого морского ежа S. intermedius
3.4. Влияние сурамина на раннее развитие морского ежа
3.5. Дифференцировка клеток морского ежа in vitro
ГЛАВА 4.ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Экспрессия генов факторов роста и генов рецепторов факторов роста в онтогенезе морского ежа
4.2. Роль факторов роста в раннем развитии морского ежа
4.3.Влияние экзогенных факторов на дифференцировку клеток
морского ежа в культуре
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ
Органы дыхания представлены 5 парами кожных жабр, расположенных вокруг рта. Нервная система представлена околоротовым нервным кольцом и 5 радиальными нервами. Половая система состоит из 5 мешковидных яичников или семенников, которые при помощи выводных протоков открываются вокруг порошицы на 5 половых пластинках. Морские ежи раздельнополые животные без выраженного полового диморфизма.
1.2.4. Роль факторов роста в онтогенезе иглокожих
Сигнальные пути, запускаемые после связывания факторов роста с их высокоспецифическими рецепторами, вовлечены в процессы гаструляции и спикулогенеза у морского ежа. Так, инкубация эмбрионов морского ежа рода Lytechinus с антителами против PDGFp млекопитающих, EGF или TGF-P человека и их рецепторов ингибирует гаструляцию и спикулогенез (Ramachandran et al., 1995). Это указывает на необходимость этих лигандов для ранней дифференцировки кишечника и образования спикул у морских ежей. Ингибирование экспрессии генов фактора роста фибробластов и генов их рецепторов ведёт к изменениям в формировании личиночного скелета (Rottinger et al., 2008).
Ген рецептора FGF (Sp-FGFR1) у морского ежа впервые был клонирован в 1996 г. (McCoon et al., 1996). Белок, кодируемый этим геном, имеет типичное строение для белка семейства FGFR, и его аминокислотная последовательность совпадает на 27-29% с аминокислотной последовательностью связывающего домена рецепторов позвоночных. Наиболее консервативным является тирозин-киназный домен у членов семейства FGFR. Благодаря альтернативному сплайсингу, у морского ежа образуются две его формы, которые различаются вставкой в центре третьего Ig-подобного домена, состоящей из 34 аминокислот, кодирующих дополнительный экзон. Транскрипты Sp-FGFR накапливаются во всех клетках эмбриона, но результаты in situ гибридизации показали, что