Индукция гепатоцитарной дифференцировки клеток слюнной железы мыши

• Автор: Петракова, Ольга Сергеевна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 152 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.Клеточные механизмы регенерации печени

1.2.Клеточная терапия патологий печени с использованием донорских гепатоцитов

1.3.Альтернативные источники клеточного материала для клеточной терапии печени.

1.3.1. Плюрипотентные клетки: ES и iPS

1.3.2. Постнатальные клетки

1.3.2.1. Стволовые и прогениторные клетки печени
1.3.2.2. ГСК и МСК костного мозга, пуповинной крови, жировой ткани
1.3.2.3. Клетки амниотической жидкости
1.3.2.4. Клетки энтодермального происхождения
1.3.3. Методика прямого перепрограммирования - использование генетических конструкций для перепрограммирования соматических клеток
1.4.Молекулярно-генетические механизмы гепатоцитарной дифференцировки
1.5.Использование деметилирующих агентов для дифференцировки клеток
1.6.Проблемы и перспективы развития клеточной терапии патологий печени
1.7.Строение поднижнечелюстной слюнной железы мыши
1.8.Культивирование клеток слюнной железы
1.9.Культивирование клеток в коллагеновом геле для анализа дифференцировочного потенциала клеток in vitro
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1.Материал ы
2.1.1. Животные
2.1.2. Реактивы
2.2.Методы

2.2.1. Выделение и культивирование постнатальных клеток поднижнечелюстной слюнной железы и прогениторных клеток печени мыши
2.2.2. Приготовление коллагенового геля. культивирование энтодермальных клеток в 30 условиях, контракция коллагенового геля
2.2.3. Приготовление парафиновых срезов коллагенового геля
2.2.4. Иммуноцитохимия и окраска клеток на Р-актин
2.2.5. Определение пролиферативной активности клеток с помощью
бромдезоксиуридина
2.2.6. Проточная цитометрия
2.2.7. Выделение тотальной РНК из клеток
2.2.8. ПЦР с обратной транскрипцией для клеток слюнной железы и
прогениторных клеток печени мыши
2.2.9. Электрофорез в агарозном геле
2.2.10. Количественная ПЦР
2.2.11. Анализ профилей экспрессии генов с помощью глубокого
секвенирования
2.2.12. Анализ действия деметилирующих агентов на клетки слюнной
железы мыши в сравнении с прогениторными клетками печени
2.2.13. Индукция гепатоцитарной дифференцировки для клеток : слюнной
железы
2.2.14. Определение уровня синтеза мочевины энтодермальными клетками
2.2.15. Статистическая обработка данных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3 Л .Морфологическая характеристика культур клеток слюнной железы мыши в 20 и
условиях культивирования в сравнении с прогениторными клетками печени
3.2.Определение пролиферативной активности клеток слюнной железы в сравнении с
прогениторными клетками печени мыши в2Э и ЗБ условиях

З.З.ОТ-ПЦР для культур клеток слюнной железы и прогениторных клеток печени мыши в 20 и ЗБ условиях культивирования
3.4.Иммуноцитохимическая характеристика клеток слюнной железы в сравнении с прогениторными клетками печени
3.5.Исследование транскриптомов культур клеток слюнной железы и прогениторных клеток
печени мыши
3.6.Анализ клеток слюнной железы и прогениторных клеток печени мыши методом проточной цитометрии
3.7.Воздействие вальпроевой кислоты на клетки слюнной железы и прогениторные клетки
печени мыши
3.8.Дифференцировка клеток слюнной железы мыши в гепатоцитарном направлении

3.9.Анализ гепатоцитарной дифференцировки клеток слюнной железы мыши в 2 Б условиях
3.9.1. Анализ гепатоцитарной дифференцировки клеток слюнной железы мыши методом иммуноцитохимии
3.9.2. Анализ гепатоцитарной дифференцировки клеток слюнной железы мыши методом ПЦР-РВ 1.
3.10. Анализ гепатоцитарной дифференцировки клеток слюнной железы мыши в 30 условиях
3.10.1. Определение степени контракции коллагенового геля дифференцированными клетками слюнной железы мыши 11?
3.10.2. Определение уровня синтеза мочевины в ЗБ условиях дифференцированньми клетками слюнной железы мыши
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ

мыши. Опытным путем с помощью реэкспрессии ключевых регуляторных генов in vivo была найдена комбинация минимального количества генов (Ngn3, Pdxl и Mafa), с помощью которых возможно перепрограммирование дифференцированных клеток взрослого организма в клетки, проявляющие свойства эндокринных клеток поджелудочной железы. Полученные клетки были схожи с эндогенными (3-клетками по размеру, форме и ультраструктуре. Они экспрессировали гены, необходимые для функционирования (3-клеток и могли уменьшать гипергликемию активно секретируя инсулин и способствуя перестройке локальных кровеносных сосудов (Zhou et al., 2008).
Что касается клеток печени, то работ, посвященных получению функционально активных гепатоцитоподобных клеток методом прямого перепрограммирования, пока немного. Это связано в основном со сложностью и многостадийностью гепатоцитарной дифференцировки, что затрудняет поиск ключевых дифференцировочных генов (Kyrmizi et al., 2006). Однако первые успехи в этой области уже получены. При индукции гепатоцитарной дифференцировки фибробластов из кончика хвоста мыши использовали лентивирусную трансфекцию 14 различных генов, играющих ключевую роль в развитии печени (Huang et al., 2011). После анализа литературы были отобраны две комбинации генов, индуцирующих эпителиальный фенотип фибробластов и экспрессию гепатоцитарных маркеров. Первая комбинация из шести генов: Foxa2, Foxa3, Hnf-la, Hnf-4a, Hnf-6 и Gata4 и вторая из восьми, включая Foxal и Hlf (Kyrmizi et al., 2006; Zaret, 2008). При исключении из комбинации Flnf-6 авторам удалось наблюдать значительное увеличение числа эпителиоподобных колоний, а исключение Hnf-4a еще более способствовало образованию эпителиоподобных колоний. Оставшиеся факторы были разделены на комбинации: Gata4, Hnf-ld, Foxa3 и Gata4, Hnf-ld, Foxa2, причем первая показала лучший результат. Интересно, что при использовании комбинации Gata4, Hnf-ld и Foxa3 наблюдалось появление экспрессии эндогенных факторов Foxa2 и Foxa3, а исключение из этой комбинации любого из генов блокировало гепатоцитарное