Хромосомы домашней курицы и японского перепела (Phasianidae, Galliformes) : сравнительный молекулярно-цитогенетический анализ высокого разрешения

• Автор: Злотина, Анна Михайловна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 148 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Класс Птицы (Aves). Краткие сведения о классификации, происхождении и эволюции
1.2. Особенности кариотипов птиц
1.2.1. Число хромосом в кариотипах
1.2.2. Структура кариотипов
1.2.3. Консервативность кариотипов
1.2.4. Происхождение микрохромосом
1.3. Исследование кариотипа и генома курицы - основа
для сравнительной цитогенетики и геномики птиц
1.3.1. Генетические карты
1.3.2. Кариотип и физические карты
1.3.3. Организация генома курицы
1.3.3.1. Центромерные районы хромосом курицы
1.3.4. Методы, используемые в сравнительной геномике птиц
1.4. Хромосомные перестройки, сопутствовавшие эволюции
кариотипов представителей отряда Курообразные (Galliformes)
1.4.1. Кариотипы домашней курицы {Gallus g. domesticus) и
японского перепела {Coturnix с. japonica)
1.5. Анализ кариотипов птиц с использованием гигантских хромосом из растущих ооцитов
1.5.1. Организация хромосом на стадии ламповых щеток птиц
1.5.2. Высокоразрешающее цитогенетическое картирование с использованием преимуществ хромосом-ламповых щеток
2. Материалы и методы
2.1. Объекты и материал исследования
2.2. Приготовление препаратов хромосом-ламповых щеток
2.3. Скрининг баз данных, содержащих информацию о
расшифрованных последовательностях генома курицы
2.4. Иммунофлуоресцентное окрашивание
2.5. Подготовка ДНК-зондов, используемых для флуоресцентной гибридизации in situ
2.5.1. Выделение ДНК ВАС-клонов
2.5.2. Мечение ДНК ВАС-клонов и целыюхромосомных зондов
2.5.3. Подготовка зондов к центромерным последовательностям курицы
2.5.4. Оценка эффективности мечения ДНК зондов
2.6. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)
2.6.1. FISH на хромосомах-ламповых щетках курицы
2.6.2. Гетерологичная FISH на хромосомах-ламповых щетках
японского перепела
2.6.3. Повторная FISH на хромосомах-ламповых щетках

2.7. Двумерная флуоресцентная и фазово-контрастная микроскопия и обработка изображений
3. Результаты
3.1. Высокоразрешающее картирование центромерных последовательностей курицы на хромосомах-ламповых щетках
3.1.1. Локализация хромосомо-специфичных центромерных сателлитных повторов на хромосомах-ламповых щетках курицы
3.1.2. Детальный цитогенетический анализ района 0-23 млн.п.н. хромосомы 3 курицы: локализация центромеры и двух нецентромерных кластеров повтора CNM относительно молекулярных маркеров
3.1.3. Локализация нетандемно повторяющихся центромерных последовательностей на хромосомах-ламповых щетках 5 и 27 курицы
3.1.4. Поиск последовательностей ДНК, гомологичных центромерным последовательностям домашней курицы,
в кариотипе японского перепела
3.2. Сравнительный молекулярно-цитогенетический анализ хромосом домашней курицы и японского перепела с использованием ламповых щеток
3.2.1. Внутрихромосомные перестройки, различающие ортологичные макрохромосомы курицы и японского перепела
3.2.1.1. Хромосома 1
3.2.1.2. Хромосома 2
3.2.1.3. Хромосома 3
3.2.1.4. Хромосома 5
3.2.2, Сравнительный молекулярно-цитогенетический анализ микрохромосом курицы и их ортологов в кариотипе японского перепела
3.2.2.1. Хромосома 11
3.2.2.2. Хромосомы 12 и 13
3.2.2.3. Хромосома 14
3.2.2.4. Хромосома 15
4. Обсуждение
4.1. Высокоразрешающий цитогенетический анализ центромерных районов хромосом-ламповых щеток домашней курицы и японского перепела
4.2. Природа различий в морфологии хромосом домашней курицы и японского перепела: формирование центромер de novo или перицентрические инверсии?
4.3. Свойства последовательностей, локализующихся на границах инверсий, различающих хромосомы курицы и японского перепела
4.4. Высокоразрешающий цитогенетический анализ хромосом и коррекция баз данных по расшифрованным последовательностям генома курицы с использованием ламповых щеток
Выводы
Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АТ - антитела
дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ - дезоксиаденозин-, дезоксигуанозин-, дезоксицитозин-дезокситимидинтрифосфат
ЛЩ - хромосомы типа ламповых щеток
млн. п.н. - миллион пар нуклеотидов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
тыс.п.н. - тысяча пар нуклеотидов
ЭНЦ - эволюционно новая центромера
AFLP (amplified fragment length polymorphism) - полиморфизм длины амплифицированных фрагментов
ВАС (bacterial artificial chromosome) - бактериальная искусственная хромосома
ССО (Coturnix coturnix japonica) - японский перепел (при обозначении хромосом)
CGH (comparative genome hybridization) - сравнительная геномная гибридизация
ChIP (chromatin immunogrecipitation) - иммунопреципитация хроматина
СМА (chromomycin АЗ) - хромомицин АЗ
CNM - chicken erythrocyte nuclear membrane associated repeat
CNV (copy number variation) - вариация числа копий сегментов ДНК
CR1 - chicken repeat
DABCO (l,4-diazabicyclo[2.2.2]octane) - 1,4- диазобицикло[2.2.2]октан)
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) - 4’-6-диамидин-2-фенилиндол DOP-PCR - degenerate oligonucleotide primed polymerase chain reaction FISH (fluorescence in situ hybridization) - флуоресцентная гибридизация in situ GGA (Gallus gallus domesticus) - домашняя курица (при обозначении хромосом) HSA (Homo sapiens) - человек разумный (при обозначении хромосом)
ICGSC - International Chicken Genome Sequencing Consortium
LINE - (long interspersed nuclear element) - длинный иптерсперсный элемент
LTR - (long terminal repeat) - длинные концевые повторы
PBS (phosphate buffered saline) - фосфатный буферный раствор
QTL (quantitative trait loci)- локусы количественных признаков

1.3.4. Методы, используемые в сравнительной геномике птиц
Наличие информации о расшифрованных последовательностях геномов позволяет проводить крупномасштабное сравнение целых геномов или их фрагментов у двух и более видов, не смотря на их таксономическое положение, что может быть использовано с целью идентификации всех хромосомных и геномных перестроек, которые сопровождали дивергенцию этих видов (Graphodatsky, 2007). Говоря о представителях класса Птицы, к настоящему моменту успешно завершены международные проекты по секвенированию генома домашней курицы (ICGSC, 2004; Schmid et al., 2000; 2005, подробнее см. раздел 1.3.3), зебровой амадины (Warren et al., 2010) и индейки (Dalloul et al., 2010); полученные данные опубликованы. Используя биоинформатические подходы тотального выравнивания расшифрованных последовательностей ортологичных хромосом этих видов, исследовательская группа под руководством проф. Д. Гриффина подтвердила наличие высокой степени консервативности синтении у птиц (Völker et al., 2010; Skinner, Griffin, 2012). Тем не менее, в данных исследованиях было обнаружено неожиданно большое число внутрихромосомных перестроек (в частности, инверсий и транслокаций), сопровождавших формирование современных кариотипов курицы, зебровой амадины и индейки. Так, в результате тотального сравнения геномов курицы и зебровой амадины удалось показать, что практически все хромосомы этих двух видов различаются наличием внутрихромосомных перестроек (Völker et al., 2010). Кроме того, данный метод позволяет сконструировать предполагаемый порядок сегментов генома общего предка курицы и индейки, а также предка, общего для целой группы Neoaves (Skinner, Griffm, 2012).
В последнее время получил распространение метод «электронного хромосомного пэйнтинга» (от англ. «Е - painting» - electronic chromosome painting). Метод основан исключительно на сравнении in silico порядка генов в геномах разных видов, тогда как протяженные контиги геномной ДНК в анализ не берутся. Данный подход позволяет упростить обычную процедуру выравнивания последовательностей целых геномов, успешно применяется для выявления консервативных синтенных блоков, хромосомных перестроек, сопутствующих