Нейрональная кальциевая сигнализация и нейродегенеративные заболевания

• Автор: Безпрозванный, Илья Борисович
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 287 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. КАЛЬЦИЕВАЯ СИГНАЛИЗАЦИЯ

НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ

1 1 9+

Нейрональная Са сигнализация

1 -2. Са2+ блокаторы и комбинированный подход к лечению

нейродегенеративных нарушений

1 Я 9 +

Нейрональная Са сигнализация и старение

1 4 9+
Нейрональная Са сигнализация и болезнь Хантингтона
1-5. Нейрональная Са2+ сигнализация и спиномозжечковые
атаксии
^ Нейрональная Са2+ сигнализация и болезнь Альцгеймера
^ ' Нейрональная Са2+ сигнализация и спорадическая БА
1.6.2. Нейрональная сигнализация и наследственная болезнь Альцгеймера. Кальциевая гипотеза патогенеза БА
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Трансгенные линии мышей
2.2. Плазмиды
2.3. Антитела
2.4. Вирусные векторы
2.5. Биохимические и молекулярные методы
2.5.1. Метод двугибридной дрожжевой системы
2.5.2. GST pull-down анализ.
2.5.3. Коиммунопреципитация и Вестерн блот
2.6. Бислойные липидные мембраны
2.7. Первичные культуры нейронов
2 g Флуориметрическая регистрация внутриклеточной
концентрации Са2+.
2.8.1. Флуориметрическое измерение концентрации Са^ в эндоплазматическом ретикулуме
2.8.2. Флуориметрическое измерение концентрации Са2+ в микросомах
2.9. TUNEL окрашивание для оценки апоптоза
2.10. Введение лекарственных препаратов мышам
2.11. Анализ координации движений у мышей
2.12. Нейропатологическое обследование мышей
2.13. Регистрация спонтанной синаптической активности
2.14. Препараты и реактивы
2.15. Статистический анализ данных
РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 3. Нарушение кальциевой сигнализации и болезнь Д
Хантингтона
3.1. Хантингтин и хантингтин-ассоциированный протеин 1 изменяют нейрональную кальциевую сигнализацию через рецептор инозитол 1,4,5-трисфосфата 1 типа.
3.2. lnsP3R1 связывается с ХАП1А в дрожжевой двугибридной
системе (Y2H).
3.3. lnsP3R1 связывается с ХАП1А и Хтт in vitro
3.4. Комплекс lnsP3R1-XAni-XTT in vivo.
3.5. Мутантный ХттехР, но не нормальный Хтт, активирует
lnsP3R1 in vitro
3.6, Мутантный ХттехР активирует lnsP3R1 в культуре СШН стриатума
3.7. БХ и нарушение Са2+ сигнализации
3.8. Сенситизация lnsP3R1 и NMDAR белком ХттехР и БХ
3.9. 9+ Нарушение Са сигнализации и апоптоз СШН при БХ.
3.10. Нарушение Са2+ сигнализации в YAC128 СШН
3.11. In vitro модель БХ
3.12. Нарушение Са2+ сигнализации и нейродегенерация СШН при БХ
3.13. Внутренние пути апоптоза, митохондрии и дегенерация СШН при БХ.
3.14. Пути, приводящие к апоптозу СШН при БХ.
3.15. Новые потенциальные мишени для лечения БХ.
3.16. Оценка клинически допустимых ингибиторов глутаматного пути в in vitro модели БХ
3.17. Нейропротекторные эффекты фрагмента С-конца рецептора инозитол 1,4,5-трисфосфата у мышей, моделей БХ
3.18. Экспрессия GFP-IC10 стабилизирует Са2+ сигнализацию в СШН YAC128
3.19. Экспрессия GFP-IC10 защищает СШН YAC128 от глутамат-индуцированного апоптоза
3.20. Экспрессия GFP-IC10 в стриатуме мыши разрушает комплекс

lnsP3R1-XTTexP
3 21 Экспрессия GFP-IC10 в стриатуме сохраняет фенотип
моторной координации у мышей YAC
3.22. Экспрессия GFP-IC10 в стриатуме уменьшает потерю нейронов у стареющих мышей YAC
3.23. Допамин усиливает глутамат-индуцированные Са сигналы в СШН дикого типа и YAC
3.24. Допаминергическая сигнализация и апоптоз СШН при БХ in vitro
3 25 Фармакология допамин/глутамат-индуцированного апоптоза
СШН при БХ
3.26. Допаминовая сигнализация и дефицит координации
движений у мышей с БХ 3 27 Допаминовая сигнализация и потеря нейронов стриатума у
мышей с БХ
3 28 Допаминергическая сигнализация и нейродегенерация СШН
при БХ
3.29. Ингибиторы допаминового пути и лечение БХ
Глава 4. Нарушение кальциевой сигнализации и спиномозжечковая атаксия 3-го типа
. . Мутантный атаксин-3 специфично связывается с InsPsRI in
' ' vitro
4.2. Мутантный атаксин-3 активирует InsPsRI in vitro
4.3. Мутантный атаксин-3 усиливает 1пБРз-индуцироемое высвобождение Са2+ из внутриклеточных Са2+ депо
4.4. Мутантный атаксин-3 связывается с lnsP3R1 in vivo
л к Дантролен облегчает дефицит координации движений у
мышей CMA3-YAC-84Q
4 Q Дантролен защищает мышей CMA3-YAC-84Q от потери
нейронов
Глава 5. Нарушение кальциевой сигнализации и спиномозжечковая атаксия 2-го типа
5 1 Мутантный атаксин-2 специфично связывается с lnsP3R1 in
vitro и in vivo
5.2. Мутантный атаксин-2 активирует lnsP3R1 in vitro
5.3. Мутантный атаксин-2 усиливает 1пэР3-индуцируемое
высвобождение Са2+ в первичной культуре клеток Пуркинье 5 4 Мутантный атаксин-2 сенситизирует клетки Пуркинье к
глутамат-индуцированному апоптозу 5 5 Дантролен облегчает дефицит координации движений у
мышей CMA2-58Q
5.6. Патологический анализ мышей, принимавших дантролен
5 7 Дантролен защищает против потери клеток Пуркинье у
мышей CMA2-58Q
Глава 6. Нарушение кальциевой сигнализации и болезнь Альцгеймера
0 1 Холопротеины пресенилины являются основными каналами
утечки кальция из эндоплазматического ретикулума

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Трансгенные линии мышей.
Для изучения патогенеза БХ использовалась трансгенная линия мышей YAC128 (Slow et al., 2003), для изучения патогенеза СМАЗ - трансгенная линия CMA3-YAC-84Q (Cemal et al., 2002), а для изучения патогенеза СМА2 -трансгенная линия CMA2-58Q (Huynh et al., 2000). При изучении патогенеза БА использовались мыши PScDKO (PS1c*TAG/dTAGi ps2~/~), которые были созданы скрещиванием мышей PS-|dTAG/dTAG с мышами PS2"A (Herreman et al., 1999). Мыши psidTAG/dTAG были созданы при помощи нокаутной стратегии. Первый экзон гена PSEN1 был окружен сайтами loxP. Вдобавок к этому, двойная метка, кодирующая кальмодулин связывающий белок (СВР), а затем метка эпитопа 3xFlag была вставлена сразу за стартовым кодоном ATG гена PSEN1. PScDKO мыши были любезно предоставлены Bart De Strooper (KU Leuven). Для изучения патогенеза БА также использовались мыши ЗхТд (KI-PS1M146V, Thy1-APPKM670/671NL, Thy1-tauP301L) (Oddo et al., 2003) и мыши APPPS1 (Thy1-APPKM670/671NL, Thy1-PS1L166P) (Radde et al., 2006). Мыши ЗхТд были любезно предоставлены Frank La Ferla (UC Irvine), а мыши APPPS1 - Mathias Jucker (University of Tübingen). Все животные находились на стандартной лабораторной диете и получали бидистиллированную воду ad libitum.
2.2. Плазмиды.
Плазмида, кодирующая lnsP3R1 крысы (Mignery et al., 1990), была любезно предоставлена Thomas Sudhof (Stanford University). Плазмиды с полными формами Htt-23Q и Htt-82Q человека (Cooper et al., 1998) - Dr Christopher A Ross (John Hopkins Univ); плазмиды с полными формами Htt-15Q и Htt-138Q человека (Wellington et al., 2000) - Dr Michael Hayden (Univ British Columba); плазмиды с полными формами ATX3-19Q, ATX3-77Q и ATX3-127Q человека (Wang et al., 2000) - Dr Nobiku Nukina (Riken); плазмиды с полными формами Atx-22Q и Atx2-58Q человека (Huynh et al., 2007) - Dr Stefan Pulst (Univ of Utah); плазмиды с полными формами пресенилинов человека (дикого типа и мутантных) - Dr GangYu (UT Southwestern at Dallas) и Bart De Strooper (Ku Leuven). Стандартные методы молекулярной биологии использовались для генерации мутаций и конструкций для экспрессии.