Роль пероксида водорода в регуляции поляризации и миграции фибробластов

• Автор: Тюрин-Кузьмин, Пётр Алексеевич
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 129 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение

Цели и задачи работы

Обзор литературы

Миграция клеток

Общие положения

Хемоаттрактанты

Сигнальные механизмы хемотаксиса и произвольной миграции

Р13-киназный сигнальный каскад

Малые О-белки Шю-семейства

Пероксид водорода как вторичный посредник

Внутриклеточный Н2Ог
Синтез и метаболизм Н2О2 в клетке
Пероксид водорода как сигнальная молекула
методы изучения сигнальных молекул при миграции клеток
Миграция фибробластов в экспериментальную рану монослоя клеток
Ингибиторный анализ
Флуоресцентные биосенсоры
Материалы и методы
Материалы
Линии клеток
Реактивы
Оборудование

Методы
Поддержание в культуре эукариотических клеток линии №Н ЗТЗ
Определение скорости движения фибробластов
Флуоресцентная микроскопия
Получение плазмид
Электрофорез и иммунноблоттинг
Результаты и их обсуждение
Р13-киназный, но не Егк/МАР-киназный каскад регулирует скорость и направленность миграции фибробластов
Участие Н202 в миграции фибробластов
Распределение Н202 в цитоплазме стимулированных фибробластов
Распределение Н202 и Р1Р3 в цитоплазме нестимулированных клеток
Возможный механизм функционирования Н202 как регулятора морфологической поляризации и скорости движения клеток
Выводы
Благодарности
Список литературы:
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
2-МЕ - 2-меркаптоэтанол;
АДФ аденозин-5'-дифосфат;
АТФ - аденозин-5'-трифосфат;
АФК активные формы кислорода;
БСА - бычий сывороточный альбумин;
ГАФД глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа;
ДМСО - диметилсульфоксид;
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;
ДСН - додецилсульфат натрия;
МБА - NjN'-метилен-бис-акриламид;
НАДФН - никотинамидадениннуклеотидфосфат восстановленный; ПААГ - полиакриламидный гель;
ТСБ - трис солевой буферный раствор, содержащий Твин20;
ФСБ - фосфатно-солевой буферный раствор;
цАМФ - циклический аденозинмонофосфат;
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота;
С5а - фактор системы комплемента;
DMEM - Dulbecco's Modification of Eagle's Medium, модифицированная по Дульбеко среда Игла;
EGF - epidermal growth factor, эпидермальный фактор роста;
ERK1/2 - extracellular signal-regulated kinases;
FBS - fetal bovine serum (эмбриональная бычья сыворотка);
fMLP - N-формилметионил-лейцил-фенилаланин;
GEF - белок фактор обмена гуаниновых нуклеотидов;
GPCR - G protein-coupled receptor - рецепторы, сопряженные с G
белком;
GDP - гуанозиндифосфат;
GTP - гуанозинтрифосфат;
Н202 - пероксид водорода;
HEPES - N-2-Г идроксиэтилпипсразин-И'-2-этансульфоновая
кислота;
НуРег - биосенсор, чувствительный к пероксиду водорода;
киназного каскада и уровня PIP3 на лидирующем крае клетки. Природа этих механизмов остается пока неизвестной.
В случае произвольной миграции механизмы выбора направления движения клетки ещё менее понятны, В процессе миграции, не обусловленной внешними причинами, так же, как при хемотаксисе,
формируется внутриклеточный градиент PIP3 (Arai et al., 2010). Механизмы образования этого градиента в настоящее время совершенно не ясны. Более того, в случае произвольной миграции фибробластов внутриклеточный градиент Р1Р3 не полностью определяет направление поляризации клеток. Ингибирование Р13-киназы и образования Р1Р3 не приводит к остановке произвольной миграции, а лишь замедляет её (Pankov et al., 2005). Вероятно, существует другой, параллельный фосфоинозитидному, механизм поляризации клетки при произвольной миграции и могут существовать какие-то внутриклеточные факторы, определяющие поляризацию клетки в определенном направлении. Эти факторы приводят к формированию
внутриклеточного градиента Р1Р3, и, параллельно, регулируют поляризацию и миграцию фибробластов по Р1Р3-независимому механизму.
В последнее время появляется много данных об участии эндогенно образующегося пероксида водорода (Н2О2) в регуляции миграции
фибробластов. Например, показано, что Н2О2 может обратимо
инактивировать фосфатазу PIP3 PTEN (Kwon J., 2004). Также существуют указания на то, что динамика сборки/разборки актиновых микрофиламентов регулируется окислительно-восстановительным потенциалом клетки (Lassing et al., 2007). Н202 может выступать тем самым фактором, который регулирует поляризацию фибробластов при произвольной миграции.