Идентификация и характеристика IbpA, малого белка теплового шока микоплазмы (Acholeplasma laidlawii)

• Автор: Вишняков, Иннокентий Евгеньевич
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 107 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
БТШ - белки теплового шока HSP - heat shock protein
«- БТШ - малые белки теплового шока а-кристаллинового типа
АТФ - аденозинтрифосфат
ОРС - открытая рамка считывания
PPLO - pleuropneumonia-like organisms (устаревшее название микоплазм)
LB - питательная среда Лурия-Бертани для культивирования микроорганизмов IPTG - isopropyl p-D-1-thiogalactopyranoside (изопропил-P-D-1 -тиогалактопиранозид) PBS - phosphate buffered saline (натрий-фосфатный буфер)
Д ЦС-ПААГ - додецилсульфат натрия - полиакриламидный гель DAB - diamino-benzidine (диаминобензидин)
BSA - bovine serum albumin (бычий сывороточный альбумин)
OD - optical density (оптическая плотность)
КОЕ - колониеобразующая единица DTT - dithiotrietol (дитиотриэтол)

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение
Цели и задачи исследования
Научная новизна полученных результатов
Теоретическое и практическое значение работы
Апробация работы
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Контроль за качеством белков в бактериальной клетке
1.2. Основные БТШ бактерий
1.3. БТШ микоплазм: история открытия
1.4. БТШ микоплазм: «гены и геномы»
1.5. Регуляция экспрессии генов БТШ в клетках микоплазм
1.6. Структура, свойства и функции БТШ микоплазм
1.7. Семейство БТШ а-кристаллинового типа (а-БТШ)
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей
2.2. Бактериальные штаммы
2.3. Клонирование гена
2.4. Получение рекомбинантного белка
2.5. Получение поликлональных антител
2.6. Иммуноблотинг
2.7. Тепловой шок
2.8. Оценка молекулярной массы олигомеров
2.9. Шапероиная активность рекомбинантного белка in vitro
2.10. Оценка влияния рекомбинантного белка на агрегацию белков E. coli
in vitro при нагреве
2.11. Оценка теплоустойчивости клеток E. coli, продуцирующих рекомбинантный белок
2.12. Электронная микроскопия
Глава 3. Результаты
3.1. Идентификация белка р17 и анализ его аминокислотной последовательности
3.2. Рекомбинантный белок IbpA и поликлональные антитела против него

3.3. Олигомерные формы рекомбинантного белка IbpA
3.4. Шаперонная активность рекомбинантного белка IbpA in vitro
3.5. Влияние рекомбинантного белка IbpA на агрегацию белков E. coli
in vitro при нагреве
3.6. Теплоустойчивость клеток E. coli в присутствии рекомбинантного IbpA
3.7. Локализация белка IbpA в клетке A. laidlawii
Глава 4. Обсуждение
Заключение
Выводы
Список литературы

1.7. Семейство БТШ а-кристаллинового типа (а-БТШ)
а-БТШ прокариот. Почти все археи имеют по 1-2 гена, кодирующие гомологи а-БТШ. Исключением является Halobacterium sp. Str. NRC-1, в геноме которой предсказаны 5 таких генов. При этом у многих архей не найдены гены, кодирующие белки DnaK, DnaJ и GrpE, являющиеся, как полагают, более важными шаперонами, нежели а-БТШ. Наличие генов а-БТШ в геномах архей в совокупности с отсутствием генов системы DnaK/DnaJ/GrpE может указывать на филогенетически более раннее происхождение белков этого семейства, чем шаперонного комплекса DnaK (Macario, Conway de Macario, 2001).
У некоторых бактерий гены, кодирующие а-БТШ, отсутствуют. Так как а-БТШ не способны обеспечить ре-фолдинг денатурированных белков, предполагают, что эти белки являются для клетки «шаперонами выбора», гены которых могут быть делетированы за ненадобностью (Narberhaus, 2002). Особенно это касается микроорганизмов со значительно редуцированным геномом, к которым относят и микоплазмы. Синтез а-БТШ клетками микоплазм до сих пор не был показан. Однако, у ряда бактерий с маленькими геномами, например, у Buchnera sp. str. APS с размером генома 0,64 Мб (Shigenobu, 2000) и Rickettsia prowazekii с геномом 1,1 Мб (Andersson, 1998), гены а-БТШ были обнаружены. В более крупных геномах некоторых бактерий, среди которых В. subtilis и ризобии, обнаружены по несколько генов, кодирующих а-БТШ (Henriques et al., 1997; Münchbach et al., 1999). Например, в экстракте клеток Bradyrhizobium japonicum были выявлены 10 а-БТШ, синтез которых был индуцирован при тепловом шоке. На основе сходства аминокислотных последовательностей они были поделены на два класса, А и В. а-БТШ класса A (HspA, HspB, HspD, HspE и HspH) оказались близкими родственниками IbpA и IbpB E. coli, а а-БТШ класса В (HspC и HspF) отличались от них значительно более протяжённой аминотермииальной областью и укороченным С-концевым участком. Наличие двух классов а-БТШ было показано и у других ризобий (Münchbach et al., 1999). У Toxoplasma gondii идентифицированы 5 а-БТШ. При этом показано, что N-концевой сегмент каждого из белков обладает уникальными характеристиками. а-БТШ Т. gondii являются конститутивно экспрессируемыми белками, за исключением Hsp30/Bagl. Эти белки локализованы в разных компартмснтах клетки. Hsp20 обнаруживали на апикальном конце клетки, Hsp28 - внутри митохондрий, Hsp29 был ассоциирован с мембраной, a Hsp21 был распределён по всему цитозолю. По-видимому, а-БТШ Т. gondii взаимодействуют с разными мишенями в клетке и, вероятно, выполняют различные функции (de Miguel et al., 2005).
Одновременная индукция экспрессии избыточных копий генов а-БТШ способствует быстрому накоплению шаперонов в клетке. Транскрипция индивидуальных генов с разных