Натриевые каналы в клетках лейкемии человека К562 и лимфомы U937: идентификация и особенности регуляции

• Автор: Сударикова, Анастасия Владимировна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 106 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
1 ВВЕДЕНИЕ

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Семейство катионных каналов ОЕСЯПМаС (дегенерины

эпителиальные натриевые каналы)

2.1.1 Молекулярная организация ОЕО/ЕМаС и их топология в

мембране

2.2 Эпителиальные натриевые каналы ЕМаС и роль актинового

цитоскелета в их регуляции

2.2.1 Структура и стехиометрия субъединиц ЕШС

2.2.2 Биофизические характеристики и фармакологическая
чувствительность Е14аС
2.3 Натриевые каналы в тканях различной специализации
2.3.1 Роль кортикального актина в регуляции натриевых каналов в
клетках миелоидной лейкемии К562
2.4 Взаимосвязь белков цитоскелета с плазматической мембраной:
роль богатых холестерином липидных микродоменов
2.5 Холестерин и его роль в функционировании ионных каналов
2.5.1 Участие холестерина и микродоменов в регуляции каналов ЕИаС
2.6 Заключение
3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 Клеточные культуры
3.2 Электрофизиология
3.3 Растворы
3.4 Обработка результатов

3.5 Модификация липидного состава
3.6 Флуоресцентная микроскопия
3.7 Выделение РНК
3.8 Обратная транскрипция
3.9 Полимеразная цепная реакция
3.10 Электрофорез продуктов ОТ-ПЦР
4 РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1 Функциональная идентификация потенциал-независимых
натриевых каналов в клетках К562
4.2 Исследование экспрессии а-, (3-, у-ЬЕИаС в клетках К562
4.3 Оценка чувствительности натриевых каналов к амилориду
4.4 Идентификация натриевых каналов в клетках 11937; связь с
динамикой актина
4.5 Организация актинового цитоскелета в клетках с пониженным 66 содержанием холестерина
4.6 Биофизические свойства натриевых каналов при снижении
уровня холестерина
4.7 Активация и инактивация натриевых каналов в клетках с
пониженным содержанием холестерина
5 ОБСУЖДЕНИЕ
6 ВЫВОДЫ
7 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
[Са2+] - внутриклеточная концентрация ионов кальция
ASIC - протон-управляемый ионный канал (Acid Sensing Ion Channel)
CapZ - копирующий белок DEG - дегенерин (degenerin)
DMSO - диметилсульфоксид
ENaC - эпителиальный натриевый канал (Epithelial Na+ Channel)
Ерев - потенциал реверсии
FaNaC - фенилаланин-метионин-аргинин-фенилаланин-активируемый (Phe-Mct-
Arg-Phe) натриевый канал
F-актин - фибриллярный актин
G-актин - глобулярный актин
Ki — константа ингибирования
M|3CD - метил-бета-циклодекстрин
NMDG+ - Ы-метил-О-глюкамин
Р0 - вероятность открытого состояния канала
TRP - transient receptor potential
ЦитБ - цитохалазин Б
ЦитД - цитохалазин Д

Показано, что целостность липидных рафтов необходима для работы мембранных систем передачи сигнала (Brown, 2006). Сообщается, что нарушения структуры и целостности рафтов, обусловленные снижением уровня мембранного холестерина, препятствуют реализации важнейших клеточных функций, включающих, в качестве ключевого звена, перестройки актинового цитоскелета (Edidin, 2003). Накапливаются данные о том, что богатые холестерином мембранные домены являются фокусной точкой (focal point) в реализации связей между плазматической мембраной и кортикальным цитоскелетом (рис. 7).
Имеются следующие экспериментальные данные в пользу этой точки зрения:
1) Некоторые белки цитоскелета, такие как (3-актин, фодрин, виментин, также как некоторые актнн-связывающис белки ассоциированы с мембранной фракцией липидных доменов (Nebl ct al., 2002).
2) Липидные домены обогащены регуляторным фосфолипидом Р1Р2, который, как известно, модулирует взаимодействия цитоскелет/мембрана (Yin, Janmey, 2003).
3) Кавеолин-1, главный структурный белок кавеол, субпопуляции липидных доменов, связан с белком актинового цитоскелета, филамином. Предполагают, что кавеолы связаны с субмембранными актиновыми волокнами. Кроме того, было показано, что удаление холестерина, обработка, приводящая к деструкции липидных доменов, вызывает диссоциацию ряда белков цитоскелета (Harder, Simons, 1999).
Было показано, что снижение уровня мембранного холестерина приводит к ослаблению некоторых цитоскелет-зависимых клеточных функций. Например, изменяется подвижность раковых клеток молочной железы (Manes et al., 1999) и Т-клеток, поляризация и миграция иейтрофилов (Pierini et al., 2003). Возможно, эти эффекты могут являться не только непосредственным результатом разрушения липидных доменов, но также и следствием изменений свойств цитоскелета, зависимых от липидных доменов (Byfield et al., 2004).
2.5. Холестерин и его роль в функционировании ионных каналов
Уровень мембранного холестерина имеет критическое значение для целостности липидных рафтов. Как известно, холестерин является одним из главных липидных компонентов плазматической мембраны клеток