Различия в морфологии и функциональной активности дермальных фибробластов в зависимости от их происхождения и условий культивирования

• Автор: Юдинцева, Наталия Михайловна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 111 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Строение кожи человека

2.2. Основные компоненты внеклеточного матрикса дермы

2.3. Внеклеточный матрикс рубцовой соединительной ткани

2.4. Функции фибробластов в процессе заживления раны

2.5. Особенности дермальных фибробластов различного происхождения

Цель и задачи исследования

Положения, выносимые на защиту'

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Выделение и культивирование фибробластов
3.2. Трехмерное культивирование фибробластов
3.3.Иммунофлуоресцентный анализ организации цитоскелета
3.4.Иммунофлуоресцентный анализ белков ВКМ, синтезируемых фибробластами
3.5. Получение белков ВКМ. синтезируемых фибробластами в двухмерных условиях культивирования
3.6. БОБ-электрофорез и иммуноблотинг
3.7. Выявление активности матрикспых металлопротеиназ
методом зимографии
3.8. Гистологический анализ биоптатов кожи
в процессе заживления ран
4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4Л. Взаимодействие дермальных фибробластов
различного происхождения с иммобилизованными белками ВКМ
4.2. Морфология фибробластов различного происхождения в гелях.
Синтез белков ВКМ в условиях двухмерного и трехмерного
культивирования
4.3. Электрофоретический анализ состава белков ВКМ, синтезируемых фибробластами различного происхождения в условиях двухмерного
и трехмерного культивирования. Иммуноблотинг
4.4. Выявление акгивности матриксных мегаллопротеиназ у фибробластов различного происхождения в условиях
двухмерного и трехмерного культивтроваиия
4.5. Гистологическое исследование бионтатов новообразованной дермы после внесения в рану фибринового и коллагенового гелей
с нормальными фибробластами
5. ОБСУЖДЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВКМ - внеклеточный матрикс
ГАГ - глюкозаминогликаны
ДТТ - дитиотриэтол
ДЭ - дермальный эквивалент
ММП - матриксная металлопротеиназа
Нф - нормальные фибробласты
Рф - рубцовые фибробласты
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
Эф - эмбриональные фибробласты
ЭФР — эпидермальный фактор роста
BSA - бычий сывороточный альбумин
II - интерлейкины
РА-1 - плазминогенный активаторный ингибитор - 1 PBS - фосфатный буфер
PBST - фосфатный буфер, содержащий PBS и 0.1 %-ный Твин-
PDGF - тромбоцитарный фактор роста
SDS - додецилсульфат натрия
ТІМР - тканевые ингибиторы металлопротеиназ
TGF-ß - трансформирующий факгор роста-ß
TNF - опухолевый фактор некроза
tPA - тканевой тип нлазминогенного активатора
иРА - урокиназный тип плазминогенного активатора
VEGF - эндотелиальный фактор роста сосудов

на установке ChemiDok> XRS (BioRad). Фотографии гелей были получены на приборе ChemiDoc XRS с помощью программы QuantityOne. Вычисление средних значений и 95 %-ных доверительных интервалов проводили при помощи программ Origin и Excel. В работе представлены данные трех и более независимых экспериментов.
3.7. Выявление активности матриксных металлопротеиназ методом зимографии
Активность ферментов у фибробластов, культивируемых в двухмерных и трехмерных условиях, определяли методом зимографии. В условиях двухмерного культивирования были взяты образцы кондиционированной среды на' сроках в-культивирования клеток: 1, 3, 7 и 10 сут. При исследовании активности ферментов у фибробластов в трехмерных условиях культивирования были взяты образцы кондиционированной клетками среды и образцы гелей с клетками на тех же сроках культивирования.
Экспериментальные образцы растворяли в буфере для проб (0.625 М Трис НС1, pH 6.8; 2%-ный SDS; 10 %-ный глицерин; 0.01 %-ный бромфенол синий) и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Белки разделяли в 4-5 %-ном разделяющем и 10 %-ном концентрирующем полиакриламидном геле в денатурирующих условиях в присутствии 10 %-ного SDS в Трис-глициновом буфере Лэммли (Laemmli, 1970) при значении тока 25 мА. Вместо воды при приготовлении гелей использовали раствор желатина (40 мг на 12 мл воды).
Для выявления положения зон, соответствующих металлопротеиназам ММП-2 и ММП-9 использовали среду, кондиционированную фибробластами линии НТ-1080, которая содержит проформы и активные формы ММП-2 и ММП-9 (Oliver etal., 1999).
После проведения электрофореза гель 2 раза по 15 мин отмывали 0.5 %-ным раствором Тритона Х-100 и выдерживали в течение ночи в растворе (50 мМ Трис-НС1 pH 7.4; 5 мМ СаС12) для выявления активности ферментов. Гель окрашивали раствором Кумасси и отмывали в 7 %-ном растворе уксусной кислоты. Изображения, полученные в электронном виде, сканировали, степень активности