Стехиометрия минорных последовательностей и гетероплазмия митохондриального генома Beta vulgaris

• Автор: Брагин, Антон Геннадьевич
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 145 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Организация мтДНК высших растений
1.1.1 Структура мтДНК высших растений
1.1.2 Последовательности мтДНК высших растений
1.1.3 Гетероплазмия мтДНК высших растений и стехиометрия отдельных участков генома
1.2 Изменчивость мтДНК и признак цитоплазматической мужской стерильности у высших растений
1.2.1 Мутации мтДНК высших растений
1.2.2 Ядерные локусы, контролирующие развитие ЦМС
1.3 Организация митохондриального генома и ЦМС у сахарной
свёклы Beta vulgaris
1.3.1 Организация мтДНК Beta vulgaris с TV- и Svulg- типами цитоплазм
1.3.2 Признак ЦМС у сахарной свёклы
1.3.3 Проблемы анализа гетероплазмии мтДНК и ЦМС у Beta vulgaris
1.4 Использование количественной ПЦР в реальном времени для детекции низкокопийных последовательностей
1.5 Определение активностей ДНК-полимераз: обзор существующих методов
1.5.1 Методы определения полимеразной активности
1.5.2 Методы определения нуклеазной активности
1.5.3 Использование методов определения активностей ДНК-полимераз для оптимизации ПЦР
1.6 Оптимизация ПЦР в реальном времени и стандартизация
флуоресцентно-меченных олигонуклеотидов
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Материалы
2.1.1 Реактивы
2.1.2 Олигонуклеотиды
2.1.2.1 Праймеры и зонды для ПЦР
2.1.2.2 Праймеры для секвенирования
2.1.2.3 Олигонуклеотиды, содержащие шпилечную структуру
2.1.2.4 Гидролизуемые зонды для определения нуклеазной активности ДНК-полимераз
2.1.3 Образцы растений
2.2 Методы
2.2.1 Выделение нуклеиновых кислот
2.2.1.1 Выделение митохондрий сахарной свеклы
2.2.1.2 Выделение ДНК из митохондрий сахарной свеклы
2.2.1.3 Выделение суммарной ДНК из проростков сахарной свёклы
2.2.1.4 Выделение мгРНК
2.2.1.5 Выделение плазмидной ДНК
2.2.1.6 Выделение плазмидной ДНК в макроколичествах
2.2.2 Полимеразная цепная реакция
2.2.2.1 Традиционная ПЦР
2.2.2.2 ПЦР в реальном времени
2.2.2.3 ПЦР в реальном времени с использованием SYBR Green
2.2.2.4 ПЦР в реальном времени с использованием гидролизуемых зондов
2.2.2.5 Мультиплексная ПЦР в реальном времени с использованием
гидролизуемых зондов
2.2.3 Клонирование и другие манипуляции с продуктами амплификаци.
2.2.3.1 Гель-электрофорез и очистка продуктов ПЦР

2.2.3.2 Клонирование продуктов ПЦР
2.2.3.3 Секвенпрование клонированных последовательностей
2.2.4 Определение полимеразной и нуклеазной активностей ДНК-полимераз
2.2.5 Определение параметров флуоресцентно-меченных олигонуклеотидов
2.2.5.1 Снятие спектров поглощения и спектров флуоресценции
2.2.5.2 Разработка программного обеспечения, предназначенного для анализа спектров поглощения и флуоресценции
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ЗЛ Анализ копийности последовательностей мтДНК Beta vulgaris методом ПЦР в реальном времени в варианте с использованием флуорохрома SYBR Green
3.2 Анализ копийности последовательностей мтДНК расширенной выборки линий и сортов Beta vulgaris методом ПЦР в реальном времени в варианте с использованием гидролизуемых зондов
3.2.1 Применение ПЦР в реальном времени для оценки копийности последовательностей мтДНК Beta vulgaris с нормировкой на универсальные маркёры мтДНК
3.2.2 Анализ присутствия универсального маркера orfB
3.2.3 Анализ стехиометрии У-специфичного маркера orf
3.2.4 Оценка копийности «SVw/ц-специфичных маркёров
3.2.5 Мультиплексная ПЦР в реальном времени для одновременной количественной детекции двух маркёров мтДНК
3.2.6. Анализ связи копийности последовательностей N- и Svulg-типа и пыльцевого фенотипа у Beta vulgaris
3.3 Оптимизация ПЦР в реальном времени для детекции низкокопийных последовательностей митохондриального генома

1.5 Определение активностей ДНК-полимераз: обзор существующих методов
1.5.1. Методы определения полимеразной активности
Классическим методом определения полимеразной активности является измерение включения в синтезируемую цепь меченного тритием ЙТМР (в случае измерения ДНК-полимеразной активности) или [3Н]-АТР (в случае измерения РНК-полимеразной активности). Продукты реакции очищаются при помощи колоночной хроматографии и сорбируются на фильтре; уровень радиоактивности отражает эффективность включения нуклеотидов в синтезируемую цепь и, как следствие, активность препарата полимеразы. Разработана модификация метода, в которой праймер несёт на себе ковалентно связанную молекулу биотина, очистка и определение активности продуктов реакции проводится на стрептавидиновой подложке (Реггап еТ а1., 1999) (рис. 5).
Нл1Кр РНК-завнсимый синтез РНК
_ , , —^ ■■■■■■■■■■■■■■
1000 Т1 Е£ЗОР*ООСЮ*ОООС
Определение радиоактивности
ф Биотин В PolyC матрица О 01igoGu праймер О GTP • [3H]-GTP Y Стрептавидин
Рис. 5. Модификация классического метода определения РНК-зависимой РНК-полимеразной активности препарата с использованием подложки сцинтилляционной близости (Scintillation Proximity Assay beads («Amersham Life Science»)). Протокол направлен на специфическое измерение включения радиоактивно меченного [ H]-GMP в биотинилированную РНК, которая затем сорбируется на SPA beads. Реакция останавливается добавлением ЭДТА в фосфатном буфере. RdRp - РНК-зависимая РНК-полимераза (по Ferrari et al., 1999).
Несмотря на то, что метод характеризуется достаточно высокой точностью (Bâillon et al., 1991) и широко используется при определении активности коммерчески доступных препаратов полимераз, для него характерен ряд недостатков, таких, как высокая трудоёмкость и опасность, связанная с использованием радиоактивных материалов. Метод плохо подходит для изучения кинетических закономерностей, так как не позволяет непрерывно отслеживать накопление продукта в ходе реакции, давая представления лишь о количестве продукта в отдельные моменты времени.