Перенос генов в клетки млекопитающих с помощью молекулярных конъюгатов: разработка носителей и оптимизация генетических конструкций

• Автор: Ефремов, Александр Михайлович
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 133 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Гешнсраиии

Доставка генов в клетки млекопитающих

Сононорацин

Электропорация

Кальций-фосфашан трансформация

Липофекция: катионные липиды и лнносомы

Рекомбинашные вирусы

Катионные пептиды: средства доставки НК и основа для молекулярных конъюгатов
Использование молекулярных конъюгатов как невирусных средств доставки ДНК
Люлиберин и его синтетические аналоги: лиганды для молекулярных конъюгатов
Лиганды трансферрннового рецептора: лиганды для молекулярных конъюгатов
Перенос ДНК методом гидродинамических внутривенных инъекций
Пренатальная гемотерапия
Стратегия «суицидальной» генотерапии опухолей
Аполипопрогеип А1 человека
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Трансформация бактериальных клеток, накопление и очистка плазмид
Деления участков пладмидной ДНК с помощью ПЦР
Формирование комплексов ДНК с катионными пептидами
Трансфекция клеточных культур
Активность перенесенного гена бакгериальной |}-галактозидазы в лизатах

Измерения активности люциферазы и лнзагах
Конфокальная флюоресцентная микроскопия
Внутрнпеннме инъекции плазмидной ДНК п хвостовую пену мышей
Измерения актиппосги люниферазм в лизатах органон мышей
Перенос комплексов плазмидной ДНК с молекулярными конъюгатами NLS-TSF7 в поверхностные ткани мышей
Определение в сыворотке кропи мышей человеческого белка ано А1
Анализ экспрессии перенесенного гена IGF
Гистологнчсскос нсслслонапнс бпошаюв
Выделение ннзкомолскулярной ядерной ДНК из тканей животного
ПЦР-аналнз
Статистическая обработка полученных результатов
ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
Лизнн-богатый пептид К8. Формирование комплексов с ДНК in vitro
Использование йен гида К8 как средеюа доепткн ДНК в клезки млекопишющих
Комплексы ДНКУК8 эндоцнтоз-оносрсдовашю проникают в клетки млекопитающих
Стрешаннднн стимулирует проникновение комплексов ДНКК8 in vitro
Комплексы ДНКК8 понижают эффективность трансформации при гидродинамических инъекциях и не способны переносить ген in vitro
Молекулярные коныоган.ь Выбор кагнонпо! о пост ел я
Полученные молекулярные конъюгаты проникают в клетки млекопитающих путем рецептор-опосредопанного эндоцшиза
Комплексы ДНК с молекулярными конъюгатами способны трансформировать клетки HcpG2, но не фибробласты
Молекулярные конъюгаты на основе аналогов люлиберина в модели суицидной iciioicpanini in vitro способны эффективно уничтожать опухолевые клетки
В отличие от комплексов ДНК1Ч1.5-1ДШН, комплексы ДНК1Чик1 способны к переносу in vivo

Гидродинамические инъекции плазмнднои ДНК в хвостовую вену беременных самок приводят к переносу рспортерного гена в з канн зародыша
При гидродинамических инъекциях комплексы ДНК'А ukl не влияют на эффективность переноса, но повышают вероятность попадания плазмидной ДНК в ткани зародыша
Молекуларпып конъюгат NLS-TSF-7 повышает эффективность переноса рспортерного гена in vivo
Перенос гена инсулиноподобного фактора роста 1 с помощью конъюгата NLS-TSF-7 в поврежденные поверхностные ткани мышей ускоряет заживление ран
Дслсционный вариант геномного Ано А1 способен поддерживать продолжительную экспрессию перенесенного гена
'-регуляторная область гена Апо А1 не способна поддерживать долі овременную экспрессию сцепленного с ними гена люциферазы
Деления третьего интрона не влияет на продолжительность экспрессии однако делеция в і орого интрона приводит к подавлению долговременной экспрессии перенесенного гена апо А1
ОБСУЖДЕНИЕ
Пептид К8 не подходит в качестве катионной части для молекулярных конъюгатов
Катионный носитель и лигандная часть для молекулярных конъюгатов
Применение молекулярных конъюгатов дчя доставки in vivo
Продолжительность экспрессии перенесенного мышам человеческого гена апо А1 зависит от второго интрона
ВЫВОДЫ
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 111 СПИСОК ЦИТИРОВАНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

его концентрация несколько ниже - 80-100 мг/дл. Кроме ЛПВП, апо А1 входит также в состав некоторых других липопротендов (хнломпкронов, лнпопротепдов очень низкой плотности), участвующих в обмене триглицеридов. Одна из основных функций апо А1 - обратный транспорт холестерина (Климов А. Н., Никульчева Н. Г. 1995). Кроме того, он способен к активации лецитннхолестерннацилтрансферазы а также обладает противовоспалительным действием (Rohrer L. et al., 2004). в последние годы исследуется роль апо А1 в регуляции иммунной системы п пересматривается значение этих взаимодействий в атерогенезе (Ansell В. J. et al., 2007; Davidson МН, Rosenson RS, 2009). Благодаря антпатерогенному действию Апо А1 часто рассматривается как потенциальный агент для терапии атеросклероза. Из-за небольшого размера гена, безопасности его экспрессии и неиммуногенностн продукта ген апо А1 (а также его цитсенновые мутации) исследуются как потенциальные мишени для генотерапни атеросклероза (Benoit Р. et al., 1999; Belalcazar L. et al., 2003; Jonathan D Smith, 2010).
ApoClII
0.3kb JL -O.Slb Apoclll Iinhanccr
Apoiv
A(X>V
Рнс. 1. Схемы организации кластера генов аполипопротеннов человека локуса llq23 (а) и хромосомного гена апо Л1 (б)
а) организация кластера генов аполипопротеннов А1, С-ІІІ, А1У, А-У человека. Протяженность кластера 116 т. н. п. Стрелками указаны направления транскрипции генов в кластере. Черным овалом обозначена локализация кластерного энхансера; б) структурная организация хромосомного гена апо АI. Полный размер гена — 1863 п.н. Е1 - Е4 — экзоны. 1 — нетранслпруемая лидерная область, 2 — сигнальный пептид, 3 — кодирует просегмент, 4 — кодирует зрелый полипептид.
Исследование природных мутантных форм апо А1, в частности т. н. «цистенновых мутаций», например Миланской и Парижской показали, что у людей, несущих мутацию, не смотря на низкий уровень ЛПВП (что является одним из факторов риска развития атеросклероза) вероятность сердечно-