Состав ядерных доменов и динамика слитого белка Y14-Мус в ооцитах жука Tribolium castaneum

• Автор: Киселёв, Артём Михайлович
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 105 с. : ил.

Оглавление
1 Введение

2 Обзор литературы

2.1 Объект исследования жук Т. castaneum

2.1.1 Ядро ооцита Т. castaneum как модельная система (оогенез)

2.2 Ядерные домены ооцитов

2.2.1 Внутриядерные тела в ядрах ооцитов насекомых

2.2.2 Кластеры интерхроматиновых гранул

2.3 Кариосфера в оогенезе насекомых

2.4 Белок Y14 как составная часть комплексов

2.4.1 Комплекс связи экзонов (EJC)
2.4.2 Деградация мРНК, содержащих преждевременный стоп-кодон (NMD)
2.4.3 Белок Y
3 Материал и методика
3.1 Объект
3.2 Методы молекулярной биологии
3.2.1 Экстракция мРНК
3.2.2 Электрофорез ДНК и РНК
3.2.3 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)..
3.2.4 Клонирование
3.2.5 Транскрипция in vitro
3.2.6 Методики биоииформатики
3.3 Микроинъекции
3.4 Флуоресцентная микроскопия
3.5 Иммунофлуоресцентное окрашивание
3.6 Иммуноэлектронная микроскопия
4 Результаты
4.1 Динамика ядерных структур ооцитов Tribolium castaneum. Кариосфера и её капсула
4.2 Ядерные тельца ооцитов Tribolium castaneum
4.3 Транскрипционная активность хромосом, собранных в кариосферу
4.4 Компоненты капсулы кариосферы
4.5 Конструкция слитого белка Y14-Myc
4.6 Транскрипция плазмиды и сплайсинг гена Y14 в клетках человека линии НЕК
4.7 Инъекции мРНК Y14-Myc в ооцит
5 Обсуждение
5.1 Трудности работы с объектом
5.2 Структурные компоненты капсулы кариосферы и активная транскрипция.
5.3 Динамика ядра ооцита
6 Выводы
7 Список литературы
8 Дополнительные материалы

Список сокращений:
BrUTP bromouridine-triphosphate, бромоуридинтрифосфат
EJC exon junction complex, комплекс связи экзонов
ESTs expressed sequence tags, маркерные экспрессируемые
последовательности
FBS fetal bovine serum, эмбриональная сыворотка крупного рогатого
скота
gap-гены гены, участвующие в самых ранних этапах развития
kDa kilodalton, килодальтон
Mb megabase, мегабаз или млн. и.п. (млн. пар оснований
NES nuclear export sequence, последовательность ядерного экспорта
NLS nuclear localization sequence, последовательность ядерной
локализации
NMD nonsense mediated decay, деградация мРНК,содержащих
преждевременный стоп-кодон ORF open reading frame, открытая рамка считывания,
последовательность нуклеотидов в составе нуклеиновых кислот, потенциально способная кодировать белок PBS фосфатно-солевой буфер
Pfu profreading polymerase, полимераза повышенной точности
PML promyelocytic leukemia bodies, PML-тельца
PTCs premature terminated codons, нонсенс стоп-кодон
RNAi RNA interference, РНК-интерференция
RNP ribonucleoprotein, рибонуклеопротеин
RRM RNA Recognition Motif, белковый домен, связывающий РЫК
SFC splicing factor compartment, компартмент, содержащий факторы
сплайсинга
SR-белки cepnn(S)/apniiniH(R)-6oraTbie белки
ТАЕ Tris-acetat-EDTA buffer, Трис-ацетатный буфер
Taq Т. aquaticus thermostable DNA polymerase, термостабильная
ДНК полимераза TBST трис-буфер с NaCl и Твин
TCR Т-клеточный рецептор
TF1ID transcriptional factor IID, транскрипционный фактор IID
TFIIH transcriptional factor IIH, транскрипционный фактор IIH
TMG-кэи, ТМГ trimethylguanosine cap, триметилгуанозиновый кэп
YNS Y14 Nuclear Signal, ядерный сигнальный домен белка Y
АТ антитела
гяРНП, hnRNP гетерогенные ядерные РНП-частицы, heterogeneous nuclear
ribonucleoproteins КИТ кластеры интерхроматиновых гранул
КК капсула кариосферы
ЛЩ лампрвые щётки
МАЛДИ матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация
мяРНК, snRNA малые ядерные РНК, small nuclear RNA
мяРНП, snRNP малые ядерные РНП-частицы, small nuclear ribonucleoproteins
ОТ-ПЦР ПЦР с обратной транскрипцией
поли(А)+-РНК полиаденилированная РНК
пре-мРНК, pre-mRNA незрелая матричная РНК, premature matrix RNA
npe-pPI IK, pre-rRNA незрелая рибосомная РНК, premature ribosomal RNA
РНК-полН РНК-полимераза II

ТГЛ тельЦа гистоновых локусов
ТК тельца Кахала
ЯТ ядерные тельца

Ма§оЬ и активировать поверхности, имеющие высокую аффинность к 5’-концу мРНК.
В настоящей работе для локализации челночного белка У14 мы использовали конструкцию, кодирующую химерный белок, содержащий последовательность белка У14 и специфическую последовательность Мус. При помощи антител к Мус-эпитопу отслеживали перемещение У14 в ядре ооцита Т. саБТапеит.