Морфологические особенности восстановления дефектов склеры при трансплантации клеток

• Автор: Баранов, Петр Юрьевич
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 110 с. : 26 ил.

Содержание
Введение

Обзор литературы

Строение склеры

Репаративная регенерация соединительной ткани

Способы восстановления дефектов соединительной ткани

Материалы и методы исследования

Выделение фибробластов дермы и склеры

Выделение и активация лейкоцитов периферической крови

Влияние супернатанта активированных лейкоцитов на пролиферацию

фибробластов
Влияние лейкоцитов на ангиогенез
Прижизненная окраска фибробластов и мононуклеаров флуоресцентными
красителями
Оценка адгезии фибробластов и мононуклеаров к склере
Операция склерэктомии
Гистологическая маркировка операционного дефекта
Трансплантация клеток крови/фибробластов дермы
Выведение животных из эксперимента, формирование групп
исследования
Морфометрическая характеристика и статистическая обработка
результатов исследования
Результаты собственных исследований и их обсуждение
Культура фибробластов дермы и склеры in vitro
Выделение и активация лейкоцитов периферической крови
Влияние супернатанта активированных лейкоцитов на пролиферацию
фибробластов
Влияние лейкоцитов на ангиогенез
Прижизненная окраска фибробластов и мононуклеаров флуоресцентными
красителями
Адгезия фибробластов и мононуклеаров к склере in vitro
Операция склерэктомии как биологическая модель дефектов склеры
Маркировка операционного дефекта
Регенерация склеры после склерэктомии
Регенерация склеры после склерэктомии с введением аутологичных
фибробластов дермы
Регенерация склеры после склерэктомии с введением активированных
аутологичных лейкоцитов
Морфометрические характеристики склеры при регенерации и
трансплантации клеток
Заключение
Выводы
Практические рекомендации
Список литературы

Введение
Восстановление структурных и функциональных дефектов склеры - важная проблема в современной экспериментальной морфологии и практической офтальмологии.
Актуальность решения этой проблемы обусловлена отсутствием эффективных методов консервативного лечения таких состояний склеры, как прогрессирующая миопия [3, 28, 42], травмы глаза - химические и термические ожоги, механические повреждения [11, 13, 65, 70, 74, 76], стафилома и фистула склеры как осложнения антиглаукоматозной операции и использования цитостатиков; атрофические состояния склеры, связанные с нарушениями иннервации или осложнением воспаления [11, 13]. Эти заболевания приводят к существенному истончении склеры и потере ей механических свойств. Нарушения проявляются как на клеточном (снижение синтетической и митотической активности), так и на тканевом (уменьшение общего числа клеток, изменение состава и соотношения компонент межклеточного вещества) уровне.
До сегодняшнего дня единственным эффективным методом лечения подобных состояний остаются склероукрепляющие операции, суть которых состоит в хирургическом укреплении склеры различными материалами. Подобный подход чреват интра- и послеоперационными осложнениями, кроме того, лишь косвенно влияет на причину истончения склеры, что приводит к необходимости повторных вмешательств, затрудненных рубцовой тканью, формирующейся после первой операции. Консервативные методы лечения и физиотерапевтический подход не обладают достаточной эффективностью, что делает поиск новых методов восстановления дефектов склеры актуальным и перспективным. Одним из таких малоизученных направлений является клеточная терапия, использующая в качестве активного компонента аутологичные или аллогенные живые клетки. Подобный подход отвечает предъявляемым к потенциальному методу лечения требованиям: он безопасен

физиологической, так и для репаративной регенерации. Наиболее яркие примеры - миосателлиты [185, 191], клетки-прогениторы мозга, хряща [91], трабекулярной кости [259], плаценты, печени, легких, селезенки. Небольшая «склонность» к мультипотентности была обнаружена и у клеточных линий, выделенных из сухожилия [285]. Точная локализация этой субпопуляции в пределах сухожилия не известна, но, как и в случае со склерой, наиболее вероятное их расположение в эндотенонии между пучками коллагена и вблизи от сосудов [125].
Использование факторов роста и цитокинов как самих по себе, так и в сочетании с носителями (фибрин, коллаген) хотя и приводит к улучшению гистоморфологических, биохимических и биомеханических свойств сухожилий [92, 172, 176, 178, 217, 332], но не дает необходимого долговременного эффекта. Клеточная терапия обладает более длительным и выраженным эффектом, кроме того МСК можно использовать в качестве «носителя» для доставки факторов роста в очаг повреждения.
Генная терапия основывается на использовании вирусных или невирусных агентов в качестве средств доставки. В случае прямого переноса генов, инъекция вектора доставки выполняется непосредственно в ткань реципиента in vivo. В случае непрямого - клетки сначала трансдуцируют/трансфецируют in vitro, после чего трансплантируют.
Для трансдукции могут использоваться ретро, адено, аденоассоциированные или лентивирусы. Они отличаются по своей способности инфицировать покоящиеся или делящиеся клетки и встраиванием своего генетического материала в ДНК клетки-хозяина.
Ретровирусы, лентивирусы и аденоассоциированные вирусы могут встраивать ген интереса в ДНК инфицированной клетки [244, 315]. Ретровирусы, в отличие от всех остальных групп, способны инфицировать только делящиеся клетки [243, 245]. В большинстве случаев используют гены, кодирующие факторы роста: основной фактор роста фибробластов или