Взаимодействие α-актинина 4 с ядерными белковыми комплексами, регулирующими экспрессию генов

• Автор: Хотин, Михаил Георгиевич
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 112 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Клеточная адгезия
1.1.1 Внеклеточный матрикс
1.1.2 Рецепторы клеточной адгезии
1.1.3 Взаимодействие интегриновых рецепторов и актинового цитоскелета
1.1.4 Изменение экспрессии генов в результате адгезии
1.2 Цитоскелет - ключевой компонент передачи сигнала от поверхности клетки в ядро
1.2.1 Организация актинового цитоскелета
1.3 Актин в ядре
1.3.1 Формы организация актина в ядре
1.3.2 Актин принимает участие в ремоделировании хроматина
1.3.3 Ядерный актин и РНК-полимеразы
1.3.4 Участие ядерного актина в созревании мРНК
1.4 Ядерные актин-связывающие белки
1.4.1 Малые актин-связывающие белки в ядре: профилин, тимозин [34 и кофилин
1.4.2 Гельзолин-подобные белки: Cap G, гельзолин и flightless
1.4.3 Белки, содержащие LIM домены - семейство зиксинов и паксилинов
1.4.4 Белки, организующие и группирующие актиновые филаменты
1.5 а-Актинии
1.5.1 Механизмы накопления а-актинина 4 в ядре
1.5.2 Белки, образующие комплексы с а-актинином
1.6 Транскрипционный фактор NF-kB
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Культивирование клеток
2.2 Нанесение клеток на иммобилизованные белки внеклеточного матрикса
2.3 Выделение клеточных ядер

2.4 Иммунопреципитация ядерных белковых комплексов
2.5 Определение состава белковых комплексов методами БОБ-элсктрофореза и иммуноблотинга
2.6 Двумерный электрофорез белков
2.7 Масс-спектрометрический анализ
2.8 Анализ экспрессии генов-мишеней р65 субъединицы ОТ-кВ
2.9 Анализ наличия изоформ а-актинипа 4 в клетках А431
2.10 Конструирование экспрессионных плазмид
2.11 Трансфекция клеток НЕК293 сконструированными экспрсссионными плазмидами
2.12 Дснситометрический анализ и статистическая обработка данных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1 Взаимодействие клетки с белками внеклеточного матрикса влияет на формирование ядерных белковых комплексов а-акганина 4 и р65 субъединицы транскрипционного фактора ИР-кВ в клетках линии А431
3.2 Зависимость активности транскрипционного фактора КБ-кВ от содержания а-актинина 4 в ядерных белковых комплексах р65
3.3 Состав ядерных белковых комплексов а-актинина
3.3.1 Анализ ядерных белковых комплексов, содержащих а-актинин
3.3.2 Выбор метода окрашивания белков в геле для последующего масс-спектрометрического анализа
3.3.3 Идентификация белков, образующих ядерные комплексы с а-актинин 4, методом МАЬБРТОР масс-спектрометрии
3.3.4 Идентификация белков, связанных с а-актинин 4 в ядерных белковых комплексах методом МАЬБ1-ТОР-ТОР
3.3.5 Подтверждение данных масс-спектрометрии методами иммунохимии
3.3.6 а-Актинии 4 взаимодействует с белками, регулирующими метаболизм мРНК
3.4 Анализ включения различных изоформ а-актинина 4 в ядерные белковые комплексы, регулирующие транскрипцию и созревание мРНК
3.4.1 Выявление новой изоформы а-актинина
3.4.2 Вовлечение изоформ а-актинина 4 в различные ядерные белковые комплексы
3.5 Влияние гиперэкспрессии изоформ а-актинина 4 на активность транскрипционного фактора №-кВ
4. ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Миоподин принадлежит к семейству синаптоподинов - пролин-богатых актин-связывающих белков, синтезирующихся преимущественно в подоцитах почек и дендритных клетках мозга. В цитоплазме мышечных клеток миоподин локализуется в Z-дисках совместно с а-актинином. В ядре установлено его участие в модуляции функций актина и в атстин-зависимом транспорте мРНК. На N- и Суконцах миоподина есть участки, сходные с NLS. Однако изменения в их последовательности не влияют на процесс перемещения белка в ядро. Кроме того, в структуре миоподина присутствует сигнал ядерного экспорта в районе с РгоЗ-Leu24 и так называемая NS (nuclear shuttling) последовательность с 30 по 60 аминокислотный остаток, связывающаяся с транспортинами и опосредующая транспорт миоподина в ядро (Weins ct al., 2001).
Экспрессия миоподина в РСЗ и LNCaP линиях клеток рака простаты сопровождается сокращением инвазии и подавлением пролиферации клеток. Показана связь между локализацией в клетке миоподина и клеточной трансформацией: в нормальных клетках уротелия миоподин находится в цитоплазме и в ядре, а в опухолевых клетках наблюдается сокращение ядерной формы. Также выявлено, что локализация миоподина способна изменяться в течение всего клеточного цикла. Кроме того показано, что тепловой шок и лептомицин В стимулируют перемещение миоподина в ядро (Sanchez-Carbayo et ah, 2003).
Другим представителем группы является пластин (фимбрин). Известно несколько его изоформ. Самые изученные из них - Т- и L- пластины, на 80 % идентичные по аминокислотной последовательности. Экспрессия L-пластина ограничена в основном гематопоэтическими клетками, такими как лимфоциты и макрофаги, а Т-пластина - плотными тканями с пролиферативным потенциалом (Delanote et ah, 2005). L-пластин может перемещаться между цитоплазмой и ядром, а Т-пластин обычно локализуется в цитоплазме, но при воздействии лептомицина В накапливается в ядре. Исследование структуры обоих типов пластинов показало, что они содержат Rev-подобный сигнал ядерного экспорта. Причем мутации в предполагаемой NES последовательности у Т-пластина оказываются критическими