Влияние фрагментированной экзогенной ДНК на рост экспериментальных опухолей мыши и активацию антигенпрезентирующих дендритных клеток

• Автор: Алямкина, Екатерина Анатольевна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 172 с. : ил.

Автор выражает большую благодарность:

В.П. Николину и H.A. Поповой (ИЦиГ СО РАН) за помощь в работе с экспериментальными животными;
B.И. Рыковой (ИЦиГ СО РАН) за содействие в проведении анализа содержания липополисахаридов;
JI.H. Гундериной (ИЦиГ СО РАН) за помощь в проведении белкового электрофореза по Лэммли и двойного окрашивания Coomassie-cepeöpo;
Е.В. Киселевой и A.A. Струнову (ИЦиГ СО РАН) за помощь в получении электронно-микроскопических снимков;
C.И. Байбородину (ИЦиГ СО РАН) за помощь в получении флюоресцентных и электронно-микроскопических снимков;
А.Г. Шилову и Я.Р. Ефремову (ИЦиГ СО РАН) за помощь в работе с культурой клеток и проточным цитофлуорофотометром;

, A.B. Таранину, Л.В. Мечетиной и Е.С. Решетниковой (ИМКБ СО РАН) за

помощь в осуществлении , экспериментов с использованием* проточной

• ' ' 1 ’ V
цитофлуорофотометрии;1
Е.Р. Черных, Л.В. Сахно, Е.Л. Гельфгат, О.Ю. Леплиной, М.А. Тихоновой и Я.А. Останину (НИИКИ СО РАМН) за помощь в работе с дендритными клетками человека;
A.C. Проскуриной, К.Е. Орищенко, Е.В. Долговой и В.А. Рогачеву (ИЦиГ СО РАН, лаборатория Молекулярной биологии клетки) за помощь и поддержку в осуществлении работы.
Отдельная благодарность научному руководителю, Сергею Станиславовичу Богачеву (ИЦиГ СО РАН), за поддержку данной работы, за помощь в планировании и осуществлении экспериментов и интерпретации результатов.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общая схема организации иммунной системы млекопитающих, отвечающей за развитие противоракового иммунитета
1.2. Пути воздействия иммунной системы на опухоль
1.3. Основные этапы формирования Т-клеточного иммунного ответа при участии дендритных клеток
1.3.1. Опухолевые антигены
1.3.2. Активация дендритных клеток
1.3.3. Активация Т-цитотоксического иммунного ответа
1.3.4. Свойства Т-регуляторных лимфоцитов
1.4. Индукция противораковой активности иммунной системы
1.5. TLR-зависимая активация дендритных клеток
? 5 ' * 7 ‘ I. 'ф * <(1н« 1 ' п , ц! . фш
1.5.1.' TLR и их основные свойства
1.5.2. Взаимодействие TLR9 и CpG-ДНК в стимуляции противоракового
1 , иммунитета
1.6. Активация дендритных клеток двуцепочечной экстраклеточной ДНК
1.6.1. RLH (RIG-like геликазный) путь передачи сигнала
1.6.2. DAI (DNA-dependent activator of interferon-regulatory factors) опосредованная индукция ИФНI типа
1.6.3. Роль IFI16 в запуске врожденного иммунного ответа
1.6.4. STING и его участие в индукции врожденного иммунного ответа
1.6.5. NOD-like рецепторы и NLR путь передачи сигнала
1.6.6. Участие AIM2 (absent in melanoma 2) в формировании инфламмасом
1.6.7. Предполагаемая роль HMGB в активации врожденного иммунитета
1.7. Противораковый эффект действия экзогенной дцДНК
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Лабораторные животные и опухолевые модели
2.2. Получение препаратов ДНК..'
2.3. Режимы введения цитостатиков доксорубицина и циклофосфана и препарата экзогенной ДНК
2.4. Прививка и измерение мышиных опухолей
2.5. Электрофорез в агарозном геле
2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле
2.7. Распластывание препарата ДНК методом Клейншмидта
2.8. Определение кислых полисахаридов
2.9. Определение нейтральных полисахаридов
2.10. Приготовление фракций препарата ДНК для инъекций мышам
2.11. Выделение мононуклеарной фракции клеток костного мозга и селезенки мыши
2.12. Получение незрелых дендритных клеток из мононуклеарной фракции клеток костного мозга мышей
2.13. Получение полилизата опухоли
2.14. Получение зрелых дендритных клеток мыши
2.15. Иммунофлуоресцентное окрашивание антителами дендритных клеток ч
мыши
# _ А’'*1'’!|1 1' 11 1' ' ' " 1 ' . ,''; 1.- ## " I;; л'.
л 2; 16. Вакцинация мышеи дендритными клетками: культивированными т хиго
2.17. Выделение фракции кровяных клеток мыши без эритроцитов
2.18. МТТ-тест мононукларной фракции крови мыши
1 2.19. Генерация дендритных клеток человека
2.20. Обработка культуры дендритных клеток человека меченой ДНК; анализ нахождения ДНК в клеточных компартментах
2.21. Характеристика доноров крови
2.22. Прединкубация дендритных клеток человека с экзогенной ДНК
2.23. Мечение препарата ДНК ВгсШ, ИТС и ТАМ11А методом Ник-трансляции75
1 2.24. Инкубация дендритных клеток человека с меченой ДНК .:
2.25. Анализ распределения меченой ДНК в дендритных клетках человека методом флюоресцентной микроскопии
2.26. Фиксация в смолу дендритных клеток человека, прединкубированных с
'< ВгбиДНК
и их дифференцировки (Lladser et al, 2011; Meylan et al., 2006; Takaoka, Taniguchi, 2008; Xie et al, 2010a; Xie et al, 2010b; Yoneyama et al, 2005; Yoneyama et al, 2004).
1.5. TLR-зависимая активация дендритных клеток
1.5.1. TLR и их основные свойства Экспериментально показано, что иммуногенные свойства ДНК, содержащей CpG-мотивы, связаны с ее воздействием на TLR, которые обнаружены в большом количестве у плазматических ДК и макрофагов (Kawai, Akira, 2006; Liu, 2005). TLR-рецепторы являются трнсмембранными белками и содержат несколько специфических доменов. Эктодомен несет лейцин-богатые повторы, через которые происходит узнавание ПАМП, трансмембранный участок и цитозольный То11-ИЛ-1 рецепторный домен (TIR), который активирует цепь дальнейших сигнальных событий. TLR-рецепторы экспрессируются либо на цитоплазматической мембране (TLR1, TLR2, TLR4, TLR5 и TLR6), либо ассоциированы с внутриклеточными везикулами (TLR3, ,.TLR7, TLR8, TI-R9 и, TLR13), к которым а относятся :>1 i;ioiспазматический ретикулум, лизосомы, эндосомы и эндолизосомы (Blasius, Beutler, 2010). К настоящему моменту известно 12 функциональных TLR-рецепторов (Kawai, Akira,12011). Каждый тип TLR-рецепторов'детектирует определенный Г1АМП вирусов, бактерий, микобактерий, грибов или паразитов. К ним относятся липопротеины и пептидогликаны, распознаваемые TLR1, TLR2 и TLR6, дцРНК (TLR3), ЛПС (TLR4), флагеллин (TLR5), одноцепочечная РНК (TLR7 и TLR8), CpG-ДНК (TLR9) (Akira et al, 2006). При распознавании соответствующих ПАМП активируется процесс передачи сигнала, в который TLR-рецепторы вовлекают специфический' набор адаптерных молекул (MyD88, TRIF), содержащих TIR-домен. Сформированный комплекс индуцирует каскад событий, приводящих к секреции провоспалительных цитокинов, ИФН 1 типа, хемокинов, и других белковых факторов (Kawai, Akira, 2010).
Наибольший интерес в плане рассматриваемой проблемы противораковой активности иммунной системы представляет TLR9, специфически связывающийся с CpG-ДНК. Этот рецептор располагается в эндосомальных компартментах в составе эндоплазматической сети. CpG-ДНК проникает в клетку через клатрин-зависимый эндоцитоз и немедленно достигает тубулярных эндосомальных компартментов. TLR,