Взаимодействие p130 - белка семейства pRb, и β-катенина - передатчика сигналов Wnt, в ходе дифференцировки и трансформации мезенхимных стволовых клеток мыши

• Автор: Петров, Николай Сергеевич
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 120 с. : ил.

Содержание

Список сокращений Введение

Актуальность проблемы Цель и задачи работы

Основные положения, выносимые на защиту Научная новизна полученных результатов Теоретическое и практическое значение работы Апробация работы

Финансовая и некоммерческая поддержка работы Структура и объем диссертации

1. Обзор литературы

1.1.Мезенхимные стволовые клетки (МСК)

История получения Свойства

Маркерная специфичность Методы приготовления Пластичность

Дифференцировка в энтодермапъном направлении в опытах in vivo Туморогенность

1.2. Характеристика сигнального пути Wnt/p-катенин
Роль сигнального пути Wnt/fi-катенин в эмбриональном периоде и после рождения
Структура белков семейства Wnt
Передача сигналов Wnt внутрь клетки
Функциональная роль мембранного ф-катенина
Механизм инактивации ф-катенина в отсутствие сигналов Wnt
Механизм действия транскрипционных факторов семейства LEF/TCF
в отсутствие сигналов Wnt
Активация зависимой от LEF/TCF и опосредованной ф-катенином транскрипции Роль сигналов Wnt в формировании лёгочного эпителия в эмбриогенезе Роль сигнального пути Wnt/ф-катенин в регуляции пластичности МСК и их дифференцировки в лёгочный эпителий
Сигнальный путь Wnt/ф-катенин при карциноме легких и кишечника
1.3. Сигнальный путь семейства гена ретинобластомы (pRb)
Члены семейства pRb и их структурная организация Функциональная роль белков семейства pRb
Взаимодействие «покетных» белков с транскрипционными факторами семейства E2F
Регуляция клеточного деления «покетными» белками осуществляется на транскрипционном уровне
Регуляция активности «покетных» белков путем фосфорилирования Специфическая роль р!30 в регуляции клеточных функций Роль ОвкЗф в регуляции активности р!30, потенциальное взаимодействие сигнальных путей pRb и Wnt/ф-катенин

1.4. Роль сигнальных путей Wnt/p-катенин и pRb в регуляции функций соматических стволовых клеток (ССК)
Концепция СК, определение и свойства различных типов СК Гипотеза механизма регуляции самоподдержания СК
Регуляция самоподдержания СК осуществляется в контексте клеточного цикла Роль сигнального пути Wnt/p-катенин в регуляции функций ССК Роль сигнального пути pRb в регуляции функций ССК
Взаимодействие между сигнальными путями Wnt/ft-катенин и pRb в регуляции функций ССК
2. Материалы и методы
Клеточные линии и культивирование клеток
Получение МСК из костного мозга трансгенных мышей, экспрессирующих зеленый флюоресцирующий белок (Gfp)
Определение пролиферативной и клоногенной активности МСК Оценка туморогенности МСК и получение клеток эксплантатов опухоли Индукция дифференцировки МСК в клетки различных мезодермальных линий Разработка модели in vitro дифференцировки МСК в клетки легочного эпителия Получение и очистка плазмидной ДНК Трансфекция клеток различных линий
Получение РНК, электрофорез РНК в денатурирующем геле и её количественная оценка
Синтез кДНК на матрице РНК и амплификация фрагментов генов с помощью ревертированной полимеразной цепной реакгщи (ОТ-ПЦР)
Ингибирование экспрессии гена WNT2 с помощью метода интерферешщи РНК Метод люциферазного репортера для оценки транскрипционной активации генов, содержащих сайты связывания белков семейства LEF/TCF Аначиз экспрессии мРНК
Синхронизация клеток в различных фазах клеточного цикла и проточная цитометрия
Иммуноцитохимические методы Электрофорез и иммуноблотинг Фракционирование кпеточных экстрактов Иммунопреципитация Статистический анализ
3. Результаты
3.1. Характеристика первичной культуры МСК костного мозга трансгенных мышей GFP в ходе их длительного пассирования
Свойства МСК на первых пассажах
Изменение морфологических свойств в ходе длительного пассирования Дифференцировочная и клоногенная способность
3.2. Оценка пролиферативной и туморогенной активности МСК в ходе их длительного пассирования в культуре
Пролиферативная активность Туморогенная активность
Характеристика клеток эксплантатов опухоли (КОЭ), полученной из МСК
3.3. Разработка модели энтодермальной дифференцировки МСК в опытах in vitro
Использование метода кокультивирования клеток для разработки модели энтодермалъной дифференцировки МСК
Кокулътивирование с клетками А-549 вызывает в МСК экспрессию маркеров лёгочного эпителия
Кокулътивирование с клетками А-549 вызывает в МСК активацию ф-катенина Ионы лития активируют /3-катенин в МСК
Индукция сигнального пути Wnt/ф-катенин сопряжена с транскрипционной активацией репортёрпой конструкции, содержащей сайты связывания транскрипционных факторов Lef/Tcf
3.4. Оценка уровня, рисунка фосфорилирования и внутриклеточной локализации белков р130 и E2f4 в МСК с индуцированным сигнальным
путем Wnt/p-катенин
Индукция сигнального пути Wnt/ф-катенин вызывает в МСК сочетанное повышение уровня и активацию р!30 и E2f4 Синхронизация МСК в различных фазах клеточного цикла Характеристика уровня и рисунка фосфорилирования рІЗО, Е2/4 и ф-катенина в МСК в различных фазах клеточного цикла
Оценка уровня продукции и электрофоретической подвижности неактивного и активного /3-катенина до и после активации в МСК сигнального пути Wnt/ф-катенин
Изучение механизма активация сигнального пути Wnt/ф-катенин в МСК при их кокулътивировании с клетками линии А
3.5. В МСК рІЗО и Р-катенин физически взаимодействуют между собой в комплексе, в состав которого входит Gsk3p
ф-катенин и р!30 копреципитируются из экстрактов МСК при использовании антител крІЗОи E2f4
Комплекс pi30-Е2/4-ф-катенин в МСК включает СвкЗф
Характеристика изменений комплекса р130-ф-катенин в ходе клеточного цикла Характеристика комплекса р!30-ф-катенин-Gsk3ф при активации в МСК сигнального пути Wnt/ф-катенин
Оценка формирования комплекса piЗО-ф-катенин-СлкЗф в ядерном и цитоплазматическом компартментах МСК
Двойная иммунофлюоресцентная окраска выявляет накопление активных форм ф-катенина, рІЗО и E2f4 в ядре МСК, обработанных LiCl
3.6. рІЗО регулирует транскрипцию генов, содержащих сайты
связывания белков семейства LEF/TCF
Комплекс piЗО-СвкЗф-ф-катенин включает транскрипционные факторы Тс/3,4 Оценка транскрипционной активности рІЗО с помощью репортёрных . конструкций, содержащих сайты связывания белков Lef/Tcf
3.7. Уровень и активность Р-катенина в ядерном компартменте МСК возрастает
в ходе их длительного культивирования
Сравнительная оценка уровня и рисунка фосфорилирования ф-катенина и рІЗО в МСК в процессе их длительного культивирования in vitro Иммунофлюоресцентная оценка выявляет повышение уровня и активацию ф-катенина в МСК поздних пассажей
4. Обсуждение результатов
4.1. Фенотипическая характеристика МСК в ходе длительного

дефосфорилированием pi30 (Popov et al., 2005). Результаты опытов с использованием метода задержки подвижности в геле согласуются с данными иммунофлюоресцентного анализа, которые показывают, что в фазе S комплексы pl30/E2f4 преимущественно локализуются в ядрышках и связаны с ядерным матриксом, а области их расположения отличаются от таковых для pRb (Zini et al., 2001). Текущие публикации содержат доказательства того, что в некоторых клеточных типах р130 не полностью разрушается после перехода G1/S. Гиперфосфорилированный pi30 в фазах S и G2/M ацетилируется и накапливается в ядрах клеток, возможно, играя активную роль в транскрипционной регуляции (Schwarze et al., 2011).
В современной литературе накапливаются данные, свидетельствующие, что супрессор pl30/E2f4 может служить основой для формирования многокомпонентных белковых комплексов, обладающих эволюционным консерватизмом и служащих для регуляции различных функций, включая дифференцировку, апоптоз, клеточное старение и дифференцировку. В клетках млекопитающих обнаружен комплекс, названный DREAM (Dp, Rb, E2f, MuvB), в состав которого входит pl30/E2f4 (Litovchick et al., 2007; Litovchick et al., 2011). Другие публикации (Pippa et al., 2011) показывают, что ингибитор Cdk2 р27Кф| физически связывает комплекс pl30/E2f4-Hdac на промоторах генов, регулирующих процессинг и сплайсинг РНК, организацию митохондрий и дыхание, трансляцию и клеточный цикл. р27к,р| коиммунопреципитируется с этими белками и выделяется при аффинной хроматографии. p27Kipl взаимодействует как с р130, так и с E2f4 через его карбоксильный конец, р 130 рекрутирует р27К|р1 к промоторам генов, на которых он опосредует последующее рекрутирование Hdac и mSin3A, вызывая транскрипционную репрессию (Pippa et al., 2011). Существуют доказательства физического взаимодействия между ß-катенином и E2f4 на промоторах генов циклина Dl и c-MYC (Baek et al., 2003). Это взаимодействие при активации продукции ß-катенина способствует освобождению гистоновой деацетилазы из комплексов E2f4/pl30-Hdacl и повышению уровня транскрипции. Механизм освобождения Hdacl основан на физическом взаимодействии ß-катенина с E2f4 и конкурентном вытеснении из комплекса Hdacl (Baek et al., 2003).
Роль Gsk3ß в регуляции активности р130, потенциальное взаимодействие сигнальных путей pRb и Wnt/ß-катенин. Современные публикации свидетельствуют, что регуляция активности pi30 путем фосфорилирования осуществляется не только циклинзависимыми киназами (Cdk), но и ключевой киназой сигнального пути Wnt/ß-катенин - Gsk3ß, которая фосфорилирует и, тем самым, ингибирует ß-катенин (Litovchick et al., 2004). Интересно, что р130 фосфорилируется Gsk3ß в фазе G0/G1 клеточного цикла, что сочетается с повышением